基于网络药理学及分子对接技术研究泽漆萜类成分抗非小细胞肺癌作用机制

张丽蓉 楼烨亮 王 可 朱美晓

肺癌是目前最为常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌的85%以上，且转移率和死亡率极高[1-2]。临床治疗肺癌多采用手术切除及化疗手段，但患者生存质量较低。中医辨证治疗在干预癌前病变、预防肿瘤转移、预防多药耐药等方面发挥重要作用[3]。泽漆（euphorbia helioscopia L.）为大戟科大戟属植物，研究表明，泽漆可通过抑制肿瘤细胞生长增殖、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移及肿瘤血管形成等机制，在肺癌、肝癌、乳腺癌等多种癌症中发挥抗肿瘤活性[4-6]。泽漆化学成分以萜类成分为主且表现出良好的抗肿瘤活性[7]。但泽漆萜类成分抗肿瘤作用靶点及机制未明确。因此本研究利用网络药理学及分子对接工具，对泽漆萜类成分抗NSCLC 的作用机制进行研究，以期为泽漆的临床使用和进一步研究提供依据。

1 研究方法

1.1泽漆活性成分筛选及靶点预测 文献中检索泽漆的萜类成分，并检索其SMILES 编码上传至Swiss ADME（http://www.swissadme.ch/）平台进行筛选，以胃肠道吸收程度（GI absorption）=“high”、Druglikeness项下多于2 个“Yes”为筛选条件即得泽漆活性成分合集。将上述筛选得到的活性成分上传至Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平台进行靶点预测，以“Probability*＞0”为条件进行筛选即得泽漆活性成分靶点合集

1.2NSCLC 相关靶基因的获取 以“None-small cell Lung cancer”为关键词分别在Gene cards 和CTD 中检索肺癌相关靶基因。将从Gene cards 中获得的NSCLC 靶基因按“Relevance score＞10”进行筛选；CTD中获得的NSCLC靶基因按“Inference Score”从大到小进行排序，选取排名前200 位的靶基因[8]。将两个数据库所得到的靶基因进行归纳整理，即得NSCLC 靶基因合集。将活性成分靶基因合集点与NSCLC 靶基因进行相互映射，获得泽漆活性成分-NSCLC 共同作用靶基因，并绘制Venn 图，即得泽漆萜类成分治疗NSCLC 的潜在作用靶点及潜在作用成分。

1.3活性成分-肺癌靶点网络构建 根据泽漆萜类成分治疗NSCLC 的潜在作用靶点及潜在作用成分，归纳整理，所得数据导入到Cytoscape 3.6.1 软件中进行网络构建，建立泽漆萜类活性成分-NSCLC 靶点网络。

1.4PPI 网络构建及网络拓扑分析 将泽漆萜类成分治疗NSCLC 的潜在作用靶点导入STRING（https://string-db.org/）平台进行蛋白互作分析，设置参数：物种“Homo sapiens”，相互作用阈值=0.400，其余参数默认。将获得的相互作用数据导出，并应用Cytoscape 3.6.1 软件中进行拓扑网络分析，并绘制PPI 网络图。

1.5GO 分类与KEGG 通路富集分析 将PPI 网络拓扑分析得到的核心靶蛋白导入DAVID 6.8 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）中，进行基因本体（GO）分类富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 分类富集分析包括分子功能分析、生物学过程分析、细胞组分分析，研究药物靶点主要信号通路，物种均设为“Homo sapiens（人类）”。以P＞0.05 为条件进行筛选，并各选取前20 条绘制气泡图（不足20 条的全部选取），最后，将分析得到的靶点、信号通路相对应，运用Cytoscape 3.6.1 软件构建靶点-信号通路网络模型。

1.6分子对接验证 整理PPI 网络中筛选得到的核心靶蛋白，利用autodock vina 对上述基因与可作用于这些基因的活性成分进行半柔性分子对接。Vina半柔性分子对接后的结合能越低，表明活性成分与靶点存在相互作用的可能性越大，通常以结合能小于-5.0kJ/mol 为标准，选取结合能最高和最低的对接结果进行展示。

2 结果

2.1泽漆抗肺癌活性成分筛选 在文献中检索泽漆萜类成分，共获得85 个萜类成分，包括71 个二萜酯类、10 个三萜类及4 个倍半萜类。Swiss ADME 平台中预测后得泽漆萜类活性成分共49 个，包括45 个二萜酯类及4 个倍半萜类（见表1）。

表1 泽漆萜类活性成分

2.2泽漆抗肺癌靶点筛选 将筛选得到的49 个活性成分上传至Swiss Target Prediction 平台中进行预测，删除重复靶基因后共得中配对得到484 个靶基因。Gene Cards 和CTD 中获得的NSCLC 靶基因筛选整理共得到1071 个靶基因。将泽漆活性成分靶基因与肺癌靶基因相互映射共得到107 个基因（见图1），表明泽漆可能通过这107 个靶基因起到治疗NSCLC 的作用。

图1 泽漆萜类成分-NSCLC 交集靶基因VENN 图

2.3泽漆萜类成分-NSCLC 靶点网络构建 根据筛选到的107 个泽漆萜类成分治疗NSCLC 靶点以及靶点与成分之间的关系，建立活性成分-抗肺癌靶点网络图（见图2）。该网络中包含154 个节点及600 条边，包含47 个活性成分节点及107 个靶点节点，节点越大表示度值越大；600 条边代表了活性成分与NSCLC 靶点间的相互作用。由Fig 2 可知，泽漆47种萜类活性成分作用于相同或不同的靶点，体现了泽漆多成分、多靶点治疗NSCLC 的特点；根据节点的大小以及度值的高低，度值排名靠前的成分分别是euphohelioscopin B（degree=36）、euphornin K（degree=35）、euphornin A（degree=35）、euphoscopin A（degree=35）及euphoscopin E（degree=34），构建这5种活性成分与靶点相互作用的网络（见图3），表明这5 种成分可能是泽漆萜类成分中治疗NSCLC 的关键成分。

图2 泽漆萜类成分-NSCLC 靶点网络

图3 泽漆萜类成分-NSCLC 靶点核心网络

2.4PPI 网络及网络拓扑分析结果 应用STRING平台对泽漆治疗NSCLC 的靶蛋白进行蛋白互作分析并应用Cytoscape 初步构建了一个包含107 个节点和1584 条边的PPI 网络A。应用CytoNCA（Version 2.1.6）插件，以Degree＞45 进行第一次筛选后构建网络B，以Betweenness＞16 进行第二次筛选后构建网络C，其过程见图4。第二次筛选后得到的网络图中度值较大的靶蛋白分别是STAT3、ERBB2、MTOR、EGFR、MDM2、AR、CASP3、SRC、CCND1、MAPK3、ESR1 及MAPK1，度值均为15，这些靶点与其他靶点关联密切，可能在治疗NSCLC 的重要靶点。

图4 PPI 网络拓扑分析结果

2.5GO 分类及KEGG 信号通路富集分析 将PPI网络第二次筛选后得到的16 个蛋白靶点上传至DAVID 6.8 平台进行富集分析，共得到211 条GO条目，包括155 条BP（生物过程），19 条CC（细胞组分）及37 条MF（分子功能）。以P 值排序，选取排名分别选取前20 条绘制气泡图（见图5）。结果显示，生物过程主要涉及PI3K 信号转导的调控、序列特异性DNA 结合转录因子活性的调控、凋亡过程的负调控、蛋白质磷酸化及基因表达的正向调控等；细胞组分主要涉及细胞质、细胞核、细胞核浆、蛋白质复合体及质膜等；分子功能主要涉及酶结合、激酶活性、转录因子结合、蛋白结合及MAP 激酶活性等，GO 分类富集结果表明泽漆萜类成分是通过多种生物学过程而发挥治疗NSCLC 的作用。

图5 GO 功能富集结果

KEGG 富集共得到84 条信号通路，以P 值排序，选取排名分别选取前20 条绘制桑吉气泡图（见图6）。主要涉及的信号通路主要有ErbB 信号通路、HIF-1 信号通路、TNF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路及多种癌症通路等，调控肿瘤细胞的增殖、生长、侵袭及凋亡等过程，表明泽漆萜类成分可通过多条信号通路发挥治疗NSCLC 的作用。

图6 KEGG 信号通路富集结果

2.6靶点-信号通路网络 将排名前20 位的信号通路与靶点相对应，归纳整理，导入Cytoscape 中构建“靶点-信号通路”网络（见图7），网络中共包括36 个节点和164 条边，其中20 个橙色三角形为信号通路节点，16 个绿色圆形为靶点节点，表明泽漆萜类成分可能通过多靶点、多信号通路而发挥治疗NSCLC 的作用。网络中，靶点节点中排名前5 的靶点分别是MAPK1、MAPK3、PIK3CA、CCND1 及EGFR，分别调控了多条信号通路，表明这5 个靶点可能是泽漆萜类成分中发挥治疗NSCLC 作用的关键成分。

图7 泽漆萜类成分抗NSCLC 靶点-信号通路网络

2.7分子对接验证结果 PPI 核心网络中的关键蛋白为STAT3、ERBB2、MTOR、EGFR、MDM2、AR、CASP3、SRC、CCND1、MAPK3、ESR1 及MAPK1，靶点-信号通路网络中的核心基因为MAPK1、MAPK3、PIK3CA、CCND1 及EGFR，结合2.3 项下获得的关键活性成分，利用autodock vina 对上述基因与可作用于这些基因的活性成分进行半柔性分子对接，见表2，结果显示活性成分与其对应的靶点分子对接结合能均小于-5.0kJ/moL，表明活性成分与靶点具有较好的结合活性，证明本文的预测结果较为可靠。选取结合能最低（Mol30 与SRC）和最高（Mol37 与PIK3CA）的对接结果进行展示，见图8。

图8 分子对接结果展示

表2 分子对接结果

3 讨论

本文基于网络药理学，整合多个数据平台对泽漆萜类成分治疗NSCLC 的可能作用机制进行研究，通过构建漆萜类活性成分-NSCLC 靶点网络，明确泽漆萜类成分中的euphohelioscopin B、euphornin K、euphornin A、euphoscopin A 及euphoscopin E 为主要活性成分，但暂未检索到目前有针对该几种成分的药理研究，缺乏实验研究佐证，后续将主要对这5种成分的抗NSCLC 作用进行深入研究。

PPI 网络拓扑分析及靶点-信号通路网络结果显示，MAPK1、MAPK3、PIK3CA、CCND1 及EGFR 可能是泽漆萜类成分发挥抗NSCLC 作用的关键靶点。MAPK3（ERK1）与MAPK1（ERK2）同属于MAPK 通路下游中重要的靶标[9]，目前基本认为ERK1 与ERK2的生物学功能类似[10]。临床检测肺癌等多种肿瘤组织ERK1 高表达[11]，肺癌组织ERK1/2 通路失调，且在肿瘤的侵袭和转移中起关键作用[12-13]。EGFR 是NSCLC中最常见的驱动基因，EGFR 基因突变可增强TK 活性，且当EGFR 与配体结合后可激活下游信号通路，促进肿瘤细胞增殖进而促进肿瘤进展[14-15]。临床上已有多种EGFR 靶向抑制剂应用于NSCLC 的治疗[16]。PIK3CA 在肺癌组织中也存在突变及过度扩增的现象[17]。EGFR 与PIK3CA 的突变往往导致AKT 的突变及过度活化，促进肺癌进一步恶化[18]。CCND1 在G1/S 期细胞周期转换中起着重要的作用，当其在NSCLC 肿瘤组织呈现高表达的状态时，肿瘤细胞可加速细胞周期进程引起细胞的快速增殖[19-20]。以上结果表明，MAPK1、MAPK3、PIK3CA、CCND1 及EGFR可能是泽漆萜类成分治疗NSCLC 的潜在作用靶点。

GO 分类和KEGG 富集分析结果显示，泽漆萜类成分抗NSCLC 作用的生物学过程主要涉及PI3K 信号转导的调控、序列特异性DNA 结合转录因子活性的调控、凋亡过程的负调控、蛋白质磷酸化及基因表达的正向调控等，通过调控ErbB 信号通路、HIF-1信号通路、TNF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路，调控肿瘤细胞的增殖、生长、侵袭、凋亡及肿瘤组织血管生成等发挥治疗NSCLC 的作用。

最后对筛选得到的活性成分及靶点进行分子对接验证，结果显示，泽漆萜类活性成分与相对应的作用靶点均展现出较好的亲和力，且结合位点均有稳定的氢键，构象稳定，有强烈的结合能力，进一步验证了本研究预测的准确性，也表明泽漆萜类成分可能通过多成分作用于多靶点发挥治疗NSCLC 的作用。

综上所述，本研究通过对泽漆萜类成分抗NSCLC 作用靶点的生物过程及信号通路进行富集分析，明确了泽漆萜类成分抗NSCLC 作用的分子机制具有多成分、多靶点、多途径的特点。这为后续实验验证提供了研究思路，而泽漆萜类成分研究较少，本研究所预测到的5 种主要活性成分均无药理研究先例，后续将对此进行深入研究。