鼠伤寒沙门菌tolA缺失株的构建及生物学功能研究

王楚，屠润妍，费霞，田一辰，李权，2*，石火英，2*

(1. 扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

沙门菌(Salmonella)属于肠杆菌科，是一种无芽孢、无荚膜革兰阴性杆菌。广泛存在于人和动物的粪便中，也是食源性疾病最重要的病原体[1]。沙门菌血清型众多，根据脂多糖抗原(O)和鞭毛抗原(H)的差异，可以将沙门菌分为2 600多种血清型，这些血清型均可引起食物性中毒[2-3]。在所有沙门菌血清型中，鼠伤寒沙门菌是最重要的食源性人畜共患病原菌之一[4-5]，其感染发病率居沙门菌感染的首位，约占人源沙门菌感染的40%～80%。人食用了污染鼠伤寒沙门菌的畜禽产品，可引发食物中毒，导致胃肠炎、败血症和伤寒等临床疾病。目前还没有有效的药物来防止鼠伤寒沙门菌的传播。显而易见，鼠伤寒沙门菌的人群感染潜力已经严重威胁了人类食品安全。因此，加强沙门菌的致病机制研究并开发有效的防控策略已刻不容缓。

外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)是一种在革兰阴性菌中普遍存在的包含生物学活性物质的囊泡状结构，其直径大小多在20～250 nm之间[6-7]。其组成成分包括脂多糖(LPS)、外膜蛋白、磷脂、DNA以及在形成过程中被外膜包裹的周质成分等。由于OMVs不能复制且包含大量具有天然构象的外膜抗原，其包含的LPS又可作为自身佐剂，能够有效激活宿主免疫系统，产生保护性免疫反应，其作为一种新颖的亚单位疫苗可以极大的提升抗原的免疫原性，因此在防控细菌性疾病中具有极大的潜力。与传统疫苗相比，OMVs疫苗具有易获取、免疫原性好、安全性高以及可定向改造等优点。但OMVs疫苗也存在产量低这一主要问题，作为免疫原，OMVs产量低是诱导高免疫保护效力和一线生产疫苗的大忌，因此如何提高OMVs的产量仍有待深入研究。

Tol-Pal系统复合体(包括TolA、TolB、TolQ、TolR和Pal)是一种细胞分裂成分，它横跨于革兰阴性菌的内膜、周质和外膜，并与肽聚糖相互作用。OMVs主要由菌体的外膜和周质成分组成，Tol-Pal系统复合体是OMVs的关键组成部分。有研究表明，大肠杆菌的Tol-Pal系统在维持细菌外膜完整性中发挥重要作用[8]，Tol-Pal系统相关基因的敲除可降低细菌外膜结构的完整性，进而显著提高OMVs的产量。这种作用在不同血清型的沙门菌中的作用似乎不同。例如有研究报道人伤寒沙门菌缺失tolR基因后，分泌的OMVs至少提高1 000倍[9]。但是鼠伤寒沙门菌缺失tolR基因后，其OMVs的产量仅仅提高2倍，提示在不同血清型的沙门菌中Tol-Pal系统相关基因对OMVs产量的影响有差异[9]。目前为止，Tol-Pal系统相关基因在鼠伤寒沙门菌中的作用及其对OMVs的产量的影响还不是特别清楚。本研究利用同源重组技术，构建了鼠伤寒沙门菌tolA基因缺失株ΔtolA，并进一评估了ΔtolA的生长特性、细菌形态、运动特性、存活能力以及OMVs的产量等生物学功能，以期探究tolA基因在鼠伤寒沙门菌中的作用及其对OMVs的产量的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒与引物

鼠伤寒沙门菌χ3761、自杀载体质粒pRE112、大肠杆菌χ7213由美国Curtiss Roy教授惠赠；鼠伤寒沙门菌缺失株ΔtolA和自杀载体质粒pRE112::CmR-tolA-LR由本试验构建；本文中所用到的引物序列如表1所示，由南京擎科生物科技有限公司合成。

表1 本文所用到的引物

1.2 ΔtolA缺失株的构建

根据GenBank中鼠伤寒沙门菌χ3761的全基因序列，找到tolA基因及其上下游序列，经扩增tolA-A和tolA-B获得目的基因上游同源臂tolA-L(301 bp)，扩增tolA-C和tolA-D获得目的基因下游同源臂tolA-R(322 bp)。然后以tolA-L、tolA-R基因片段为模板进行融合PCR，扩增缺失了目的基因的tolA-LR片段(623 bp)，随后将tolA-LR克隆到自杀载体pRE112(pRE112::CmR-tolA-LR)，接着转化至2, 6-二氨基庚二酸(DAP)缺陷菌株χ7213中，酶切和序列鉴定正确后冻存。吸取供体菌χ7213和受体菌χ3761各1滴，混合后接种于LB(含50 mg/mL的DAP)固体培养基上，将结合菌在含25 μg/mL氯霉素的LB平板上划线。挑取单菌落于LB液体中培养至云雾状，随后涂布于含5%蔗糖的LB平板上，如果细菌只在普通固体培养基中生长，而在氯霉素培养基中不生长，此类菌落为疑似成功的基因缺失株，选用tolA外部引物(A/D)进行鉴定，筛选ΔtolA缺失株(见图1)。

图1 缺失株ΔtolA的构建示意图

1.3 ΔtolA缺失株生长曲线的测定

将-80 ℃冻存的χ3761和ΔtolA用接种环在LB固体培养基上三区划线，第2天挑单菌落至LB试管中培养，培养至对数生长期(OD600=0.9)，然后按1∶200的比例分别接种到50 mL LB培养基中。在37 ℃恒温摇床180 r/min摇床振荡培养12 h，之后每隔1 h测1次OD600的读值，记录并绘制生长曲线。试验独立重复3次。

1.4 革兰染色观察

取一张干净的玻片，用注射器抽取生理盐水滴一滴到玻片中央，将接种环放于酒精灯外焰灭菌，接着挑取菌落，均匀涂抹在生理盐水上，做成直径为1 cm的薄层，再将接种环灭菌放回，最后把玻片置于酒精灯外焰干燥固定。首先在固定过的涂片菌膜上滴加草酸铵结晶紫染液初染1 min后，用细小的水流冲洗；然后加碘液媒染1 min，用细小水流冲洗；接着加95%酒精，并轻轻摇动进行脱色，20～30 s后再进行水洗；最后加石炭酸复红染色液复染1 min后进行水洗，将玻片自然干燥，镜检拍照。

1.5 菌体的透射电镜观察

为了检测敲除tolA基因是否影响χ3761的表型变化，参考之前报道进行透射电镜观察[10]。将χ3761和ΔtolA培养至对数生长期(OD600=0.9)，PBS洗涤2次后，用5%的戊二醛室温固定2 h，然后再用2%四氧化锇固定2 h。样品用不同浓度的丙酮梯度脱水，嵌入环氧树脂中后制作切片，将切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅分别染色，随后在透射电子显微镜上以80 kV的加速电压进行观察拍照。

1.6 运动性检测

将χ3761和ΔtolA培养至对数生长期(OD600=0.9)，PBS洗涤2次后，各吸1 μL滴于含有0.50%琼脂和0.02%阿拉伯糖的LB平板上，随后放置于37 ℃培养箱中培养5 h，最后取出平板测量菌圈直径，试验独立重复3次。

1.7 脱氧胆酸钠和万古霉素敏感性检测

将χ3761和ΔtolA培养至对数生长期(OD600=0.9)，随后收集菌体，PBS清洗2次后与终浓度0.5%的脱氧胆酸钠或PBS在37 ℃孵育2 h，然后将细菌梯度平板计数统计其存活率差异。沙门菌存活率表示为(0.5%脱氧胆酸钠中细菌CFU/PBS中细菌CFU)×100%。万古霉素敏感性测定根据文献报道采用Kirby-Bauer圆盘扩散技术[11]，万古霉素片含有30 μg的抗生素。试验独立重复3次。通过测定缺失株对脱氧胆酸和万古霉素的抵抗力差异推断菌株外膜结构的完整性。

1.8 OMVs的提取

挑取χ3761和ΔtolA单菌落分别于5 mL的LB液体培养基过夜培养，各取3 mL按1∶100比例扩大培养至300 mL LB液体培养基中，置于恒温摇床，200 r/min，37 ℃培养，摇菌至OD600=1.0，8 000 r/min，离心30 min，收集上清液，用0.45 μm的细菌滤器过滤，接种少量滤液于LB固体培养基，置于37 ℃恒温培养箱过夜培养，以检测滤液是否彻底无菌，将无菌滤液转移至超速离心管中，30 000 r/min，4 ℃超速离心3 h，弃其上清液，将沉淀重悬于1 mL无菌PBS中，随后将粗提的OMVs样品进行密度梯度离心，在离心管中依次加入浓度不连续的Optiprep (Axis-Shield)梯度分离液(依次为45%，40%，35%，30%，25%，20%)，将OMVs样品加入液体最上方，30 000 r/min，4 ℃超速离心过夜。根据SDS-PAGE结果将某一浓度下富集的OMVs分离液进行再次超速离心，得到的沉淀即为富集的沙门菌OMVs，置于-80 ℃保存备用。所有的OMVs样品在提取和纯化过程中至少独立重复3次。

1.9 OMVs的透射电镜观察

电镜观察采用负染色法，取5 μL OMVs样品滴在具有膜的铜网上，静止10 min后滤纸吸去多余悬液，然后滴加2%的磷钨酸染液于铜网上，静止5 min后滤纸吸去多余染液，自然半干后透射电镜观察OMVs的形态并拍照记录结果。

1.10 OMVs中蛋白浓度的测定

用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测所提取OMVs中的蛋白浓度，根据试剂盒说明书，用96孔板进行检测。首先将蛋白标准品稀释至0.5 mg/mL，作为蛋白标准液；然后配制适量BCA工作液，充分混匀；随后将蛋白标准液配置成合适的浓度，分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL；加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20 μL，需加PBS补足到20 μL；各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置20～30 min；冷却至室温后，用酶标仪测定A562的吸光值，记录数据；根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

1.11 OMVs中脂类含量的检测

脂类含量的测定参考之前报道的方法[12]。首先取等体积的OMVs样品与FM4-64分子探针在37 ℃孵育10 min，FM4-64分子探针浓度为3.3 μg/mL，用不添加探针的OMVs样品和单独的FM4-64探针分别作为阴性对照。随后，我们使用506 nm激发波长和750 nm发射波长进行荧光测量。试验独立重复3次。

2 结果

2.1 重组自杀质粒的构建与验证

PCR结果显示，在623 bp处有特异性阳性条带(见图2)，与预期的融合片段大小相符。双酶切结果也显示自杀载体pRE112::CmR-tolA-LR构建成功(见图3)。

M. DNA分子质量标准；1、2. 阳性克隆菌落图2 重组自杀质粒的PCR鉴定

M. DNA分子质量标准；1、2. 阳性克隆菌落图3 重组自杀质粒的酶切鉴定

2.2 ΔtolA缺失株的构建与验证

基于同源重组的原理，将χ3761作为受体菌，含有重组自杀质粒pRE112::CmR-tolA-LR的χ7213作为供体菌，通过不断的筛选和鉴定，对疑似突变体进行了PCR检测，结果显示缺失株的同源臂引物tolA-AD扩增出来的片段大小比在亲本株中的片段小一个目的基因长度，证明缺失株构建成功(见图4)。

M. DNA分子质量标准；1. χ3761；2. ΔtolA图4 ΔtolA缺失株PCR鉴定

2.3 生长曲线的测定

为了探究缺失tolA是否会对χ3761的生长产生影响，分别检测了χ3761与ΔtolA的生长曲线。结果显示，两株菌的生长特性没有明显的差异(见图5)。

数据为“平均值±标准差”。下同图5 χ3761与ΔtolA生长曲线

2.4 革兰染色观察

为了探究缺失tolA是否会对χ3761的菌体形态产生影响，分别对χ3761与ΔtolA进行了革兰染色并观察。结果显示，χ3761呈革兰阴性、两端钝圆的短杆菌，而突变株ΔtolA形态发生明显改变，如红色箭头所指菌体呈球形，散在、成对或短链状分布(见图6)。试验结果提示，缺失tolA后很可能对χ3761的外膜完整性产生影响，进而影响菌体的形态结构。

图6 χ3761与ΔtolA革兰染色光学显微镜观察

2.5 透射电镜观察

为了进一步探究缺失tolA是否会对χ3761的菌体形态产生影响，随后对χ3761与ΔtolA进行了透射电镜观察。结果显示χ3761形态正常，呈短杆状。ΔtolA呈多个相连的椭圆形，菌体周围有许多OMVs分泌，与野生株相比，ΔtolA缺失株形态发生明显的改变(见图7)。该试验结果证实缺失tolA后确实对χ3761的外膜完整性产生了影响，进而影响菌体的形态结构，最终可能影响OMVs的产量。

左侧两图为χ3761，右侧两图为ΔtolA图7 χ3761与ΔtolA透射电镜观察

2.6 运动性检测

对χ3761与ΔtolA的运动能力进行检测的结果显示，ΔtolA的菌圈直径大约为6 mm，野生株χ3761的菌圈直径是缺失株的2.17倍，数据表明将tolA基因缺失后，χ3761的运动能力显著下降(见图8)。

A.运动性检测；B.迁移直径差异分析**表示差异极显著(P<0.01)。下同图8 χ3761与ΔtolA的运动性检测

2.7 脱氧胆酸存活率和万古霉素的敏感性检测

为了探究tolA基因是否是影响鼠伤寒沙门菌外膜的完整性，比较了χ3761和ΔtolA在0.5%的脱氧胆酸钠中存活率的差异。外膜完整性的受损会导致菌株对脱氧胆酸钠的敏感性增加。结果显示，脱氧胆酸钠中ΔtolA的细菌计数显著低于野生株，说明敲除tolA基因降低了χ3761对脱氧胆酸钠的抵抗能力(见图9A)。与野生株相比，ΔtolA的外膜完整性受到破坏可能是其在脱氧胆酸钠中存活率下降的主要原因。为进一步研究tolA对外膜完整性的影响，分析了χ3761和ΔtolA对万古霉素的敏感性。结果显示，ΔtolA对万古霉素完全敏感，χ3761对万古霉素完全耐药(见图9B)。ΔtolA突变体对脱氧胆酸钠和万古霉素的敏感性增加，证实缺失株外膜完整性受到破坏。

***表示差异极显著(P<0.001)。下同图9 χ3761与ΔtolA的脱氧胆酸钠存活率(A)和万古霉素的敏感性(B)检测

2.8 OMVs的透射电镜观察和OMVs产量测定

为了进一步探究tolA是否影响鼠伤寒沙门菌OMVs的形成，提取了χ3761与ΔtolA的OMVs并进行了透射电镜观察。结果显示，χ3761产生的OMVs多为圆形或椭圆形(黄色箭头)，并且含有大量鞭毛(蓝色箭头)。ΔtolA产生的OMVs除了圆形和椭圆形外，还有很多不规则的杆状结构(红色箭头)。与野生株相比，ΔtolA缺失株OMVs形态发生了明显改变(见图10A)。值得注意的是，与野生株相比缺失株OMVs中鞭毛显著减少，这可能是ΔtolA运动性下降的原因。随后，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测了OMVs的蛋白浓度，从χ3761中提取的OMVs蛋白的平均浓度为0.17 mg/mL，从ΔtolA中提取的OMVs蛋白的平均浓度分别为1.25 mg/mL，缺失株OMVs的蛋白浓度明显高于野生株(见图10B)。脂质含量测定与蛋白质含量测定结果相一致(见图10C)。ΔtolA中OMVs脂质含量与野生株OMVs相比提高了11.4倍。

A. OMVs的透射电镜观察；B. OMVs蛋白浓度差异分析；C. OMVs脂质含量差异检测图10 χ3761与ΔtolA OMVs的透射电镜观察和OMVs产量测定

3 讨论

细菌感染仍然是导致人类和动物死亡的主要原因之一[13]。由于耐药菌的增加和快速传播，抗生素治疗细菌性疾病的有效性受到了挑战。因此，疫苗被认为是后抗生素时代应对细菌性疾病最直接有效的策略[14]。细菌性疾病亚单位疫苗由于其生产工艺简单、成本低及安全性高等优势，成为细菌疫苗的重要发展方向。此类疫苗主要由原核表达系统(如大肠杆菌)大规模生产，表达产物通常无法进行正确的加工和折叠，影响表达蛋白的构象导致免疫原性较差。除了安全性外，评价一个疫苗的另一个重要指标就是其免疫原性。因此如何提高细菌性疾病亚单位疫苗的免疫原性成为首要解决的问题。由于OMVs含有大量的细菌抗原，并能有效激活宿主免疫系统，其作为一种新颖的亚单位疫苗可以极大的提升抗原的免疫原性，因此在防控细菌性疾病中具有极大的潜力[15]。与传统亚单位疫苗相比，OMVs作为疫苗载体存在诸多优势：首先，免疫原性好。OMVs为典型的纳米颗粒结构，有利于进入淋巴管并被抗原递呈细胞高效摄取，另外OMVs包含大量天然构象的外膜抗原，可有效刺激机体的体液和细胞免疫反应；其次，OMVs可作为有效的天然佐剂：OMVs含有LPS，可诱导宿主产生高效的免疫应答，因此OMVs具有显著的疫苗开发潜力。

研究发现Tol-Pal系统相关基因在维持细菌外膜完整性中发挥重要作用，很可能参与OMVs的生物发生[16-17]。目前关于tolA基因的相关研究大多是针对大肠杆菌属的病原菌，在其他致病菌中的研究还相对较少。本文以tolA基因为研究对象，旨在探讨其在鼠伤寒沙门菌中的作用及其对OMVs产量的影响。

本研究成功构了鼠伤寒沙门菌基因缺失株ΔtolA，通过对野生株和缺失株的生长特性、细菌形态、运动特性、存活能力以及OMVs的产量等生物学功能进行比较，解析tolA基因在鼠伤寒沙门菌中的作用。透射电镜观察发现，野生株χ3761的OMVs样品中可以看到大量鞭毛，而ΔtolA缺失株OMVs中没有明显的鞭毛。缺失株鞭毛的减少可能是ΔtolA运动能力下降的重要原因。此外，本研究tolA基因的敲除改变了沙门菌的细胞形态，菌体呈链状、球形且表面有囊泡。在S.Typhi[18]和Erwiniachrysanthem[16]的tol-pal突变体中也可以观察到类似的表型。造成这种现象的主要原因是菌体的外膜完整性受到了破坏[19]。人们在前期研究中发现，Tol-Pal系统介导的磷脂酰甘油运输机制可能会影响细菌外膜的稳态，进而改变细胞形态[19-20]。本研究发现，tolA基因的缺失显著降低了鼠伤寒沙门菌在脱氧胆酸钠中的存活率，并表现出对万古霉素的高度敏感性。有文献报道革兰阴性菌对万古霉素敏感性的增加是由于其外膜受到破坏而通透性增加所导致[21]。这些数据表明，tolA突变体的外膜完整性受到破坏。

有文献报道,OMVs组分中蛋白质和脂肪的含量与OMV产量正相关[9]。本研究结果证实，将tolA基因缺失后，χ3761的OMVs产量显著增加。由于鼠伤寒沙门菌tolA突变体外膜完整性受到破坏且其表面出现明显的囊泡，推测tolA基因可能参与OMVs的生物发生过程。进一步发现，鼠伤寒沙门菌ΔtolA缺失株的OMVs产量显著高于野生株，证实TolA是OMVs生物发生过程中的关键蛋白。

综上，本研究发现，鼠伤寒沙门菌tolA基因的缺失严重抑制了细胞的运动能力，破坏了细胞的形态，破坏了外膜的完整性。此外，tolA基因也参与了OMVs的生物发生。这些研究结果为Tol-Pal系统相关基因的进一步研究提供了理论基础，同时为之后鼠伤寒沙门菌OMVs的疫苗开发提供理论参考。