调节环磷酸腺苷对绵羊卵母细胞减数分裂恢复的影响

杨炳雪，白玥，赵玉芬，娜美尔格，苏布登格日勒*，李海军*

(1. 内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2. 内蒙古自治区基础兽医学重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018)

在哺乳动物中，卵母细胞成熟的质量是保证其持续发育能力的必要前提。卵母细胞质量在动物体外生产中非常重要[1]，其中体外模拟体内卵母细胞成熟过程是一个关键环节。人们普遍认为，造成体外成熟(IVM)效率相对较低的部分原因，在于体外卵母细胞的核质不同步成熟[2]。众所周知，第二信使cAMP在维持哺乳动物卵母细胞减数分裂停滞中起着重要作用[3]。卵母细胞内高浓度的cAMP，可以维持卵母细胞的减数分裂停滞状态，且其受磷酸二酯酶(PDE)和腺苷酸环化酶(AC)的调控，分别参与cAMP的降解和合成。越来越多的证据表明，在卵母细胞体外成熟过程中调节cAMP，可能是解决IVM的卵母细胞与体内成熟的卵母细胞之间发育能力差异的一种方法[4]。通过在IVM过程中，使用PDE抑制剂西洛酰胺来防止卵丘卵母细胞复合体(COCs)中cAMP浓度降低[5]。

促性腺激素诱导cAMP水平的增加与卵泡中类固醇激素的增加有关[6]。动物体内雌激素的活性以17β-雌二醇(E2)最高，具有广泛的生理功能。长期以来，睾酮和E2一直被认为在卵母细胞的自发减数分裂恢复过程中发挥作用[7]。然而，在大鼠卵泡中发现，E2可诱导减数分裂激酶的活性，从而为有丝分裂调控卵泡发育提供了证据[8]。Soares等[9]研究也表明，E2与不同的因子联合添加到卵母细胞IVM体系中，可以维持卵母细胞的减数分裂停滞状态，显著增加生发泡(GV)期卵母细胞的比例。因此，推测E2可能参与维持卵母细胞的减数分裂停滞作用。

为了提高体外成熟培养卵母细胞的发育能力和质量，研究人员提出了双相体外成熟系统，在成熟前对cAMP进行调节，即在IVM前期添加PDE抑制剂与/或AC激动剂[10]。相对于常规IVM，双相IVM系统使卵母细胞发育能力得到改善[11]。目前的研究发现，小鼠[12]、山羊[13]、绵羊[14]、人[15]等的卵母细胞在双相IVM系统的培养下，发育潜能均有提高。故此，在体外成熟培养系统中探讨与应用高效cAMP促进剂已成为研究热点。本研究首先在常规体外成熟培养体系中，测定了PDE3的抑制剂西洛酰胺的作用效果，随后在双相体外成熟系统添加高低浓度E2和/或西洛酰胺，探讨其对绵羊COCs内cAMP水平以及卵母细胞减数分裂恢复的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

TCM-199(tissue culture medium-199)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自Gibco公司；雌二醇(E2)、促黄体生成素(LH)和卵泡雌激素(FSH)购自宁波第二激素厂；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、PBS、DAPI染色液、石蜡油、BSA、透明质酸酶和凡士林均购自Sigma公司；ELISA试剂盒购自Cayman公司；西洛酰胺购自Med Chem Express公司。

1.2 绵羊COCs采集

在呼和浩特市某屠宰场，采集选取约6～8月龄的小尾寒羊卵巢，置于30～35 ℃的生理盐水中，于3 h内带回实验室，采用剖割法划取卵巢表面2～6 mm的卵泡获取绵羊COCs，并在立式显微镜下，选取3层以上致密的卵丘细胞层及卵胞质均匀的COCs，进行体外成熟培养。

1.3 绵羊COCs的体外成熟培养

在四孔板中分别加入或不加入10 μmol/L 西洛酰胺的成熟液(9.70 mg/mL TCM199+10%FBS+2.38 mg/mL Hepes+0.20 mg/mL丙酮酸钠+0.02 U/mL FSH+0.12 U/mL LH+1 μg/mL E2)，将COCs随机平分到四孔板中，放入39 ℃、含5%二氧化碳的培养箱中，进行体外成熟培养，在不同时间(0 h、30 min、1 h、2 h)，分别测定绵羊卵母细胞与卵丘细胞内cAMP水平。

1.4 绵羊COCs的双相体外成熟培养

在四孔板中分别加入：成熟液(9.70 mg/mL TCM199+10%FBS+2.38 mg/mL Hepes+0.20 mg/mL丙酮酸钠+0.02 U/mL FSH+0.12 U/mL LH+1 μg/mL E2)，0.5 ng/mL E2，1 μg/mL E2，10 μmol/L 西洛酰胺的预成熟液(处理组加，对照组不加)，预成熟液为9.70 mg/mL TCM199 +2.38 mg/mL Hepes+0.20 mg/mL丙酮酸钠+1 mg/mL无脂肪酸BSA。将COCs随机平分到四孔板中，放入39 ℃、含5%二氧化碳的培养箱中进行体外成熟培养。在0 h和2 h，分别测定绵羊卵母与卵丘细胞内cAMP水平；2 h后将COCs转移至正常成熟液的四孔板中，继续常规培养4 h后，检测生发泡破裂(GVBD)发生情况。

1.5 绵羊卵母与卵丘细胞cAMP水平测定

1.5.1 绵羊卵母与卵丘细胞样品的制备

体外成熟培养不同时间后，取出四孔板，在0.3%透明质酸酶中分离获得卵母细胞和卵丘细胞，随后在0.1 mol/L HCl中静置裂解30 min。裂解完成后吹打，1 000 r/min离心10 min，上清液用ELISA Buffer稀释，涡旋离心2次后，分别获得卵母与卵丘细胞样品，保存备用。

1.5.2 竞争ELISA检测

按照ELISA试剂盒说明书进行操作。依次定量加入ELISA Buffer、标准品、样品、cAMP乙酰胆碱酯酶示踪剂和抗血清后，在4 ℃中孵育18 h，用Wash Buffer清洗拍干；再将Ellman’s试剂和Tracer加入指定孔中，室温条件下摇床避光孵育90～120 min；多功能酶标仪在412 nm波长下检测OD值，以标准物浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，计算样本中的cAMP水平。

1.6 DAPI染色

培养结束的COCs，置于含有0.3%透明质酸酶中孵育5 min，移液枪反复吹打至裸卵，将其转移至4%多聚甲醛中，4 ℃过夜固定。固定完成后，用PBS洗涤3次，将裸卵转移至载玻片，在盖玻片上滴注粘片剂，进行压片至卵母细胞充满卵周隙，1%Triton透化15 min，PBS洗涤卵母细胞，1 μg/mL的DAPI避光染色10 min，然后PBS再洗3次。在荧光显微镜下观察卵母细胞核状态，并记录每组GV期卵母细胞率、GVBD期卵母细胞率和MⅠ期卵母细胞率。

1.7 数据分析

所有的试验均至少重复3次，用Excel软件初步整理试验数据，再用ELISA Calc.exe和GraphPad Prism 5.0软件对试验数据进行统计分析，试验结果用“平均值±标准误”表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 西洛酰胺对绵羊卵母细胞和卵丘细胞内cAMP的影响

2.1.1 cAMP标准曲线

采用竞争ELISA法检测绵羊卵母细胞与卵丘细胞裂解物中cAMP水平，结果显示R2值为0.999 82，表明西洛酰胺含量与cAMP测定值具有良好的相关性，cAMP水平检测的标准曲线见图1。

图1 添加西洛酰胺的cAMP标准曲线

2.1.2 西洛酰胺对绵羊卵母细胞与卵丘细胞内cAMP水平的影响

试验测定了PDE3抑制剂西洛酰胺(10 μmol/L)对体外成熟后绵羊卵母细胞与卵丘细胞内cAMP水平变化的时间效应，结果见图2。

A. 卵母细胞cAMP水平；B. 卵丘细胞cAMP水平；每组10个COCs至少重复3次；同组之间比较，不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，下同；*表示相同时间点组间差异显著(P<0.05)，**表示相同时间点组间差异极显著(P<0.01)；图2 西洛酰胺对绵羊卵母细胞和卵丘细胞中cAMP水平的影响

由图2可见，对照组和处理组卵母细胞体外培养30 min、1 h与2 h，cAMP水平均极显著高于0 h(P<0.01)。与对照组比较，处理组卵母细胞内cAMP水平均有升高，其中30 min与2 h组分别显示极显著差异(P<0.01)与显著差异(P<0.05)(图 2A)；而卵丘细胞内cAMP水平在30 min与2 h时，对照组和处理组中均无明显变化，但添加处理1 h时，卵丘细胞内cAMP水平与对照组相比显著升高(P<0.05)(图2B)。

2.2 雌二醇与西洛酰胺预处理对绵羊COCs内cAMP水平的影响

2.2.1 cAMP标准曲线

采用竞争ELISA法检测绵羊卵母细胞与卵丘细胞裂解物中cAMP水平，cAMP水平检测的标准曲线见图3。试验结果显示，R2值为0.999 72，表明各试验组预处理与cAMP测定值具有良好的相关性。

图3 E2与西洛酰胺预处理的cAMP标准曲线

2.2.2 雌二醇与西洛酰胺预处理对绵羊COCs内cAMP水平的影响

添加不同浓度E2(0.5 ng/mL或1 μg/mL)和西洛酰胺(10 μmol/L)体外预成熟培养2 h后，分别检测绵羊卵母与卵丘细胞内cAMP水平，结果见图4。在卵母细胞中，正常对照组，与0 h对照组cAMP水平相同，而预处理对照组的cAMP水平降低近1/2，无显著性差异(P>0.05)。与预处理对照组相比，西洛酰胺组、0.5 ng/mL E2组和联合添加组(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2、西洛酰胺+1 μg/mL E2)cAMP水平均明显升高，且联合添加组(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)cAMP水平最高，与预处理对照组相比差异显著(P<0.05)；1 μg/mL E2组相比于预处理对照组，cAMP水平略有升高，但差异不显著(P>0.05)， 见图4A。

在卵丘细胞中，与正常对照组相比，0 h对照组cAMP水平略低，而预处理对照组的cAMP水平降至约1/2水平，与预处理对照组相比，西洛酰胺组、0.5 ng/mL E2组和联合添加组(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)cAMP水平均显著升高(P<0.05)，且均与预处理对照组有显著差异(P<0.05)，而联合添加组(西洛酰胺+1 μg/mL E2)相对于预处理对照组，其cAMP水平略有升高，而1 μg/mL E2组cAMP水平略微降低，但差异均不显著(P>0.05)；另外，联合添加组(西洛酰胺+1 μg/mL E2)cAMP水平相对于西洛酰胺组略有降低，而相对于1 μg/mL E2组cAMP水平略有升高，表明联合添加可能存在拮抗效应，而联合添加组(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)cAMP水平相对于西洛酰胺组和0.5 ng/mL E2均有升高，表明联合添加可能存在累加效应，见图4B。

A. 卵因细胞cAMP水平；B. 卵丘细胞cAMP水平；Cil是西洛酰胺的简称图4 E2与西洛酰胺预处理COCs对cAMP水平的影响

2.3 雌二醇与西洛酰胺预处理COCs对绵羊卵母细胞核成熟的影响

为了验证cAMP水平变化对绵羊卵母细胞减数分裂进程的影响，试验利用DAPI染色技术，观察并记录了处于GV、GVBD及MⅠ期卵母细胞核的状态特征，观察结果见图5。GV期：染色质呈絮状、丝状，可观察到完整的核膜(图5A)；GVBD期：核膜破裂，染色体高度浓缩，呈四分体形态(图5B)；MⅠ期：染色体清晰可见，整齐地排列在赤道板上(图5C)。

A. GV期；B. GVBD期；C. MⅠ期图5 绵羊卵母细胞GV、GVBD及MⅠ核状态

在双相体外成熟系统中，测定不同浓度E2(0.5 ng/mL和1 μg/mL)和西洛酰胺(10 μmol/L)单独或联合添加对绵羊卵母细胞GVBD发生的影响，结果见表1。各组在体外预成熟培养2 h和常规成熟培养4 h后，正常对照组GV期卵母细胞率为62.9%，预处理对照组与正常对照组相比，GV期略有上升但差异不明显(P>0.05)。与预处理对照组相比，西洛酰胺组、0.5 ng/mL E2和联合添加组(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)GV期卵母细胞率显著升高(P<0.05)，GVBD期卵母细胞率显著降低(P<0.05)。1 μg/mL E2组和联合添加组(西洛酰胺+1 μg/mL E2)与预处理对照组、0.5 ng/mL E2组和西洛酰胺组及联合添加组(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)比较，1 μg/mL E2组、西洛酰胺组与联合添加组(西洛酰胺+1 μg/mL E2)之间卵母细胞各期比率无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 E2与西洛酰胺预处理COCs对绵羊卵母细胞核成熟的影响

3 讨论

近年来关于家畜卵母细胞体外成熟技术改良已取得诸多进展，但卵母细胞体外成熟的效率仍低于体内成熟，这使得由体外成熟而来的家畜体外胚胎仍难以在育种实践中被广泛应用[16]。当前研究表明，cAMP调节剂在核成熟过程中发挥关键作用[17-18]，因为cAMP是参与减数分裂停滞和恢复的基本因素，它与进一步的发育能力有关。

实验室前期的研究显示，在体外成熟培养中，添加10 μmol/L西洛酰胺的效果最好[19]，因此，本研究在常规成熟体系中添加10 μmol/L的西洛酰胺，试图探讨其在含促性腺激素等在内的体外成熟体系中，其对绵羊卵母细胞与卵丘细胞内cAMP含量的影响。本研究发现，分别添加西洛酰胺处理30 min与2 h时，可显著提高卵母细胞内cAMP水平。这与Buell等[20]研究结果相一致。在卵母细胞IVM期，添加Forskolin和IBMX处理30 min时，cAMP水平达到峰值。西洛酰胺是PDE3的特异性抑制剂[21]，但本试验发现在1 h时，西洛酰胺也可以显著提高卵丘细胞内cAMP水平。这可能是由于前人与本试验研究的时间有所差异，或者是由于卵母细胞与卵丘细胞之间的缝隙连接开放[22]，从而导致卵母细胞内cAMP流向卵丘细胞，使卵丘细胞内cAMP水平有所增加。

在上述试验的基础上，本试验在双相IVM中的预处理阶段添加10 μmol/L 西洛酰胺和不同浓度的E2(0.5 ng/mL和1 μg/mL)后，发现0 h对照组与正常对照组相比，卵母细胞cAMP水平相同，而预处理对照组降至约1/2水平，说明上述外源性激素可能具有维持卵母细胞内cAMP水平的作用。对小鼠的研究发现，促性腺激素具有维持卵母细胞内cAMP水平的作用[23]。在常规体外成熟培养6 h后，GV期卵母细胞率为62.9%，与Ni等[24]研究发现基本一致，其GV期卵母细胞率为67.2%。另外，与预处理对照组相比，西洛酰胺组cAMP水平显著升高, 与本研究的结果相类似。Park等[25]研究发现，用西洛酰胺预处理猪COCs，可显著提高卵母细胞的cAMP水平。另外，与预处理对照组相比，西洛酰胺组GV期卵母细胞率显著升高，GVBD期显著降低。Gharibi等[26]研究发现，西洛酰胺能够明显阻滞体外成熟培养的绵羊卵母细胞减数分裂恢复。相对于预处理对照组，0.5 ng/mL E2组的cAMP水平和GV期卵母细胞率显著升高，而GVBD期显著降低；而1 μg/mL E2组的cAMP水平、GV期卵母细胞率与对照组及GVBD期差异不显著。蔡姣[27]和张骏鸿[28]研究发现与本试验结果相似，添加低浓度(0.27 ng/mL或2.7 ng/mL)E2，可显著促进GV期卵母细胞率，而高浓度(1 μg/mL)E2，可显著降低GV期卵母细胞率。此外，本试验联合添加组(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)与预处理对照组相比，其cAMP水平与GV期卵母细胞率呈显著差异，均高于单独添加西洛酰胺和0.5 ng/mL E2组，表明联合添加可能起到累加效应。与预处理对照组相比，联合添加组(西洛酰胺+1 μg/mL E2)cAMP水平明显升高，且与0 h对照组呈显著性差异，但其GV期卵母细胞率无显著差异，表明高浓度雌激素与西洛酰胺联合添加未起到最佳效果。而在卵丘细胞中显示，与预处理对照组相比，西洛酰胺组、0.5 ng/mL E2组和联合添加组(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)均显著提高cAMP水平，联合添加组(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)显示最优效果，且与0 h对照组呈显著性差异。在目前的文献中，尚未发现西洛酰胺和E2联合添加的试验，这也是本试验的创新点之一。综上，本研究在双相体外成熟系统的预成熟阶段，添加西洛酰胺和0.5 ng/mL E2，然后进行常规IVM培养，促进卵母细胞的核质同步成熟，进而提高后续胚胎的发育能力。

4 结论

在IVM培养时添加西洛酰胺可以提高体外成熟绵羊卵母细胞内cAMP水平；利用西洛酰胺和0.5 ng/mL E2构建绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟培养体系。在双相IVM系统中，单独或者联合添加西洛酰胺和0.5 ng/mL E2预成熟培养2 h，能够显著提升卵母细胞内cAMP水平，阻滞减数分裂进程，对改善卵母细胞体外成熟质量具有积极作用。