残留恩诺沙星对鸡粪厌氧消化特性影响研究

＊王涵 于佳滢 刘晨熙 郑凯兮 宋佳楠 冯磊*

（1.沈阳航空航天 大学能源与环境学院 辽宁 110136 2.沈阳航空航天大学 民用航空学院 辽宁 110136）

引言

中国是全球农业大国之一，农业废弃物更是广泛应用于畜牧养殖业。近年来农业废弃物的年产量成指数型增长，每年秸秆的产量高达3亿吨，而鸡粪的产值更是高达4亿吨，这些废弃物的产量是工业固体废物的1.29倍。如果这些废弃物没有被有效处理将会导致病原体释放、污染大气、土壤污染、温室气体排放等环境问题，面对大量的农业废弃物，存储后集中利用、堆肥处理和厌氧消化处理这三种方式被广泛使用[1-2]。厌氧消化是一种成熟的技术，是利用沼气厌氧发酵处理畜禽粪便最常用的技术。如果活性抗生素的浓度超过临界水平，厌氧消化过程及其在粪便处理和沼气生产中的应用可能会因为产甲烷联合体的抑制而受到抑制。因此，应该清楚地了解抗生素对厌氧消化工艺性能的影响，目前全球不仅面临着大量粪污合理处置问题，还要兼顾抗生素诱导的抗生素抗性基因进入食物链的生态安全问题，它是一种将废弃物转化为沼气和可利用资源的处理方案。

在中国，东北地区的畜牧业生产基地最为集中，抗生素是抑制或杀死其他微生物的代谢产物，兽用抗生素作为防治畜禽疾病的药物尤为重要。兽用抗生素可以作为畜牧业的添加剂饲料，动物养殖业最常用的抗生素是四环素（45.2%），四环素是一种广谱抗菌剂，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有抗菌活性，因此被广泛用作人和动物感染的治疗剂。四环素也用于亚治疗，用于预防和促进生长。当四环素被细菌细胞吸收时，它通过阻止氨酰tRNA与核糖体的相互作用来抑制蛋白质的合成。鉴于微生物在厌氧消化中的重要作用，研究在抗生素存在下厌氧微生物群落的特征对于确定对甲烷和挥发性脂肪酸（VFA）生产的潜在影响至关重要。各类的研究报告表明，当厌氧反应器暴露在抗生素中时，沼气量普遍减少，主要是甲烷的减少[3-4]。其中猪粪中四环素类药物残留率和残留水平较高。众所周知，磺胺类化合物是一类人工合成的抗生素，在细菌酶促合成二氢叶酸过程中可以作为对氨基苯甲酸的拮抗剂。兽医也经常使用磺胺类化合物作为动物生长促进剂。而氟喹诺酮类fluoroquinolones（FQs）药物在鸡粪中频繁检出，其中恩诺沙星残留浓度高达15.43mg/kg·TS。Enrofloxacin（ENR）是第一个动物专用的喹诺酮类药物，属于广谱抗生素，主要对革兰氏阴性菌有杀灭作用，通过抑制细菌的DNA螺旋酶活性，干扰DNA复制，从而阻断增殖。氟喹诺酮类药物在单胃物种口服后易被吸收，对于反刍动物的吸收效率则较低，较难达到治疗水平。恩诺沙星在成年反刍动物中的口服生物利用度只有10%，而在单胃动物的口服生物利用度超过80%，吴等人对国内采集的畜禽粪便样品进行分析，检测到环丙沙星和恩诺沙星抗生素在猪粪中的含量分别高达33.98mg/kg和33.26mg/kg，经过厌氧消化处理后抗生素的去除率分别为60.3%～70.4%和48.4%～77.1%[5]，这解释了喹诺酮类药物频繁用于治疗禽类疾病的原因，抗生素作为生物抑菌剂对厌氧体系微生物的活性会有所削弱，不同浓度和种类的抗生素对厌氧消化系统的毒性效应已有报道。

中国每年生产抗生素原料大约21万吨，其中9.7万吨应用于畜禽养殖业中[6]。目前四环素类、磺胺类、大环内酯类抗生素对牛粪、猪粪便厌氧消化的影响研究较为广泛，但缺乏喹诺酮类抗生素在对鸡粪厌氧消化粪的影响以及降解规律的研究。基于以上考虑，根据中国东北地区鸡粪中恩诺沙星残留水平，探究恩诺沙星对鸡粪厌氧消化系统的影响，重点分析微生物群落结构变化，与此同时，分析了恩诺沙星在鸡粪厌氧消化体系中降解特性，为日后的畜禽粪便管理提供数据支持。

1.实验材料与方法

(1)实验材料

本实验所用鸡粪取自辽宁省北票市某肉鸡养殖基地，经检测鸡粪中恩诺沙星浓度低于检出限，可以确定鸡粪未受污染。将鸡粪中蛋壳、羽毛、石子等难降解的物质剔除，置于4℃下冰箱保存待用；恩诺沙星购自上海阿拉丁公司，化学式为C19H22FN3O3，相对分子质量为359.39，纯度≥98%，使用前置于4℃冰箱保存；接种污泥取自沈阳市某污水处理厂浓缩池，加入鸡粪37℃驯化2周后使用。鸡粪与接种污泥特性如表1所示。

表1 鸡粪、秸秆和接种物的性质

(2)实验方法

本次实验以新鲜鸡粪与喹诺酮类抗生素恩诺沙星为研究对象，取鸡粪120g，接种污泥300ml，设置4组实验M1-M4，其中M1-M4恩诺沙星含量（以鸡粪VS计）分别为0mg·kg-1、10mg·kg-1、20mg·kg-1、40mg·kg-1，将物料添加进序批式反应器后用去离子水定容至1L进行厌氧消化实验。反应器置于的恒温水浴锅中，水浴加热温度通过温度传感器显示并通过温控箱进行温度调控，温度设置为37±0.2℃，实验周期为50天。期间分析研究日产气量、累计产气量、pH、主要酶（纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）的活性等参数的变化规律。具体分析检测方法如表2所示。

表2 各实验参数分析检测方法

2.结果与讨论

厌氧消化的效率可以通过甲烷产量的高低进行评判，其余的工艺参数均可以用于评估厌氧消化的稳定性[7]。不同含量恩诺沙星与鸡粪联合厌氧消化累积甲烷产量变化分析如下，M1-M4累积甲烷产量变化趋势大致相同，甲烷前期产量不高，均存在较为平缓的趋势，随着反应的不断进行，甲烷产量呈现出先增加后趋于稳定的发展趋势，从四组实验的甲烷产气量对比可以得出结论，不同含量恩诺沙星与鸡粪联合厌氧消化各组实验甲烷累积产量由大到小顺序为：M1＞M2＞M3＞M4，最终甲烷的累积产量（以VS计）分别为240.56mL·gVS-1、190.49mL·gVS-1、181.06mL·gVS-1、139.27mL·gVS-1。同时实验过程中测得的甲烷浓度也是评估厌氧消化反应过程稳定性的重要指标，M1-M4实验组产生的甲烷浓度平均值分别为61.12%、60.63%、57.22%、53.58%。为单一组分抗生素的实际沼气工程提供理论指导和技术支持。

由于粗纤维、淀粉、粗蛋白是鸡粪的主要成分，实验过程中监测了纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、脲酶四种水解酶以及脱氢酶。脱氢酶活性的强弱通常作为衡量活性污泥性能的指标，一定程度上反映了菌群的活性状态[8]。实验初期中高浓度ENR脱氢酶活性更高，而中后期脱氢酶活性有较大差别。脲酶活性明显随ENR浓度的增加而升高，说明高浓度ENR对以含氮有机物为底物的水解菌活性更有益。但根据产气结果，M1、M2较高的酶活性并未促进整个厌氧反应的进行，20mg/kg·TS，40mg/kg·TS ENR对产甲烷反应有一定的消极作用。纤维素酶可以将纤维素降解为寡糖或单糖[9]，主要分泌菌群有：Megasphaera、Bacteroides、unidentified_Spirochaetaceae和Candidatus_Cloacimonas等，通过对比可以看出纤维素酶相对于淀粉酶和蛋白酶活性较高，其中M1组纤维素酶活性要高于M2、M3和M4组，且M1在40d左右达到峰值为270.57U·mL-1，M2、M3和M4组在第30d左右达到峰值分别为242.67U·mL-1、240.46U·mL-1和220.15U·mL-1，这一结果表明，未添加抗生素的空白组提高厌氧消化过程中纤维素酶活性，提高了对原料的利用率。蛋白酶主要水解原料中粗蛋白分子间的肽链而形成氨基酸，淀粉酶负责葡萄糖的释放和多糖的水解[10]，脂肪酶主要催化甘油三酯转变为甘油和脂肪酸，其在水解酸化过程中的优势菌群主要有：Candidatus_Cloacimonas、Lactobacillus、Ruminiclostridium和Bacteroides，对比M1-M4四组实验结果表明，M1组蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、活性均高于M2、M3和M4组，M1组各水解酶峰值为：133.82IU·L-1（蛋白酶）、335.47IU·L-1（淀粉酶）、470.76U·L-1（脂肪酶），M2组各水解酶峰值为：107.69IU·L-1（蛋白酶）、318.73IU·L-1（淀粉酶）、404.81U·L-1（脂肪酶）。而M3组蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均在40天左右达到峰值，峰值为：106.81IU·L-1（蛋白酶）、277.00IU·L-1（淀粉酶）、431.12U·L-1（脂肪酶）。根据这一结果我们同样可以认为，由于抗生素的添加会导致厌氧消化酶活性的降低，没有添加抗生素的空白组水解酶的活性和原料的利用率均高于添加抗生素组。

厌氧消化过程本质是由多种微生物共同作用形成的，这是一个十分复杂的反应过程。厌氧消化系统中包含多种厌氧微生物，其中产甲烷古菌和水解酸化细菌为优势微生物菌群，水解酸化细菌为产甲烷古菌提供生长繁殖的营养物质和适宜的氧化还原电位，产甲烷古菌为水解酸化细菌解除由于氢和VFAs累积而产生的反馈抑制，因此厌氧消化过程依靠多种微生物共同作用完成，并且微生物相互关联又相互制约。完整的微生物动力学特征可以通过表示了菌群群落的丰富度、多样性和均匀性的α多样性来表示。通过16SrRNA技术对细菌、古菌共40个样本测序，得到序列后以97%的序列相似性聚类到OUTs中。通过Alpha多样性分析，对各处理的微生物群落的丰富度和多样性进行估计，厌氧消化过程中各组实验细菌和古菌的α多样性，从OTU、丰富度、均匀度和多样性等指标可以发现，细菌群落价值要高于古菌群落，这与之前的研究结果一致，在不同采样时期对α多样性进行进一步比较显示，随着厌氧消化的性能下降，所有指标均表现出不同规则的波动，这正如其他研究所提到的，生物系统的多样性可以表示厌氧微生物群落的发展历程。均匀度指数（Chao1值）和ACE能够反映群落丰富程度，指数越高，微生物群落丰富程度越高。Shannon指数可反映厌氧微生物相对丰度，该指数越大表明优势菌群生物量占总生物量比重越小。Simpson指数是指在样本数据中随机抽取的两个OTU是不同物种的概率。可以得出概率越大样本中的物种多样性越高，概率越小样本中的物种丰富度越低。Simpson指数可以评估优势物种在群落中的地位和作用。细菌的OTU数量要比古菌的OTU数量大很多，并且细菌的Shannon、Simpson、Chao1、ACE指数均大于古菌，说明在整个厌氧消化实验过程中细菌物种的丰富度和均匀度高于古菌。比较四组实验可以看出M2（鸡粪VS:秸秆VS=9:1）物种丰富度和均匀度更高，因此可以看出添加适当比例的秸秆对厌氧消化过程有促进作用，能提高对原料的利用率。

3.结论

（1）在厌氧发酵第6～13d和23～29d，恩诺沙星对甲烷日产气速率有显著的抑制作用，在30d后对甲烷产气速率影响不大；在整个厌氧发酵过程中，恩诺沙星降低了厌氧发酵沼气总产气量，且会随着浓度的增加而影响加剧，恩诺沙星影响下厌氧发酵水解酶活性与沼气产气量呈正相关。

（2）M1组的各水解酶活性均高于M2、M3和M4，抗生素的添加抑制了厌氧消化过程中微生物活性，抑制了厌氧消化系统中微生物降解有机质的水解速率和产甲烷速率，且一定程度上降低了酶的活性。

（3）实验中细菌的Shannon、Simpson、Chao1、ACE指数均大于古菌，即细菌物种的丰富度和均匀度高于古菌，M2（鸡粪VS:秸秆VS=9:1）物种丰富度和均匀度最高，添加适当比例的秸秆对厌氧消化过程有促进作用，能提高对原料的利用率。