NaCl胁迫对宁夏枸杞叶和幼根显微及超微结构的影响

马晓蓉，杨淑娟，姚 宁，王玲霞，马 强，梁文裕

(宁夏大学 生命科学学院, 银川 750021)

叶和根作为植物主要的营养器官，承担着重要的生理功能。研究表明，盐胁迫会对植物叶肉细胞叶绿体和线粒体的结构产生明显影响[1-2],如白三叶在碱性盐胁迫下叶片叶绿体内部的基粒片层膨胀解体，排列疏松，部分模糊不清，基粒片层层数减少[3]。随着盐胁迫加重，秀丽四照花叶绿体内的淀粉粒、脂滴、噬锇颗粒数量增多,基粒片层结构松散、肿胀[4]。桉树在盐胁迫下叶绿体出现超大淀粉粒，类囊体膜发生扩张[5]，而且盐胁迫条件下甘薯叶片线粒体内膜嵴肿胀[6]。因此，盐胁迫对植物叶绿体和线粒体具有明显的伤害作用。此外，作为植物最早感受盐胁迫的器官，根系对盐胁迫也异常敏感，如盐胁迫下小麦通过降低根系总的吸收面，增强根系活力，提高对K+的吸收能力等途径来适应盐胁迫[7]。盐胁迫下大麦根尖分生区细胞中内质网和高尔基体丰富，质体和线粒体大量出现[8]。因此，盐胁迫下根的生长发育和结构变化直接反映了植物对盐胁迫的响应程度和耐受能力。

宁夏枸杞(Lyciumbarbarum)是茄科枸杞属多年生落叶灌木，具有较强的耐盐碱能力[9]。结果表明，随着盐浓度的增加，枸杞根系质膜和液泡膜H+-ATPase活性逐渐升高，且液泡膜H+-ATPase活性高于质膜H+-ATPase活性[10]。陈金龙[11]用不同浓度盐溶液处理枸杞后发现，随着盐浓度的增加，植株生物量下降；叶绿素含量、过氧化物酶活性，可溶性蛋白先增后降；脯氨酸、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性一直增加。枸杞幼苗叶绿素含量、气孔导度、净光合速率和蒸腾速率等光合作用参数随着盐浓度的增大而受到显著抑制[12]。此外，毛桂莲等[13]对NaHCO3胁迫条件下宁夏枸杞叶的结构变化研究表明，随着胁迫浓度增加，叶绿体结构破坏，基粒片层排列紊乱，淀粉粒增多，栅栏组织的细胞结构紧密度逐渐降低，层数逐级减少。因此，高浓度的盐胁迫对宁夏枸杞的生理和结构均产生了显著影响。

宁夏枸杞作为著名的耐盐药用植物，其耐盐机制的研究主要集中在生理及分子生物学领域[6-12]。由于植物耐盐机制是其结构、生理和分子调控的综合反应，因此，研究NaCl胁迫下宁夏枸杞器官和细胞的结构变化对深入解析宁夏枸杞耐盐机制具有重要意义。目前，NaHCO3胁迫条件下宁夏枸杞叶的结构变化研究已有报道，但NaCl胁迫下宁夏枸杞叶和幼根细胞超微结构的变化并未明确。因此，本研究通过分析宁夏枸杞在NaCl胁迫条件下叶片和幼根细胞显微及超微结构的变化，阐明宁夏枸杞响应NaCl胁迫的结构基础，为深入研究宁夏枸杞耐盐机理和培育耐盐新品种提供理论基础和科学依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

以宁夏枸杞“宁杞1号”为试验材料，将饱满种子用蒸馏水冲洗后萌发5 d，栽植在珍珠岩∶蛭石∶基质为1∶1∶1比例混合的穴盘中，用Hoagland营养液浇灌，在温度(25±2)℃，湿度42%，光强700 μmol·m-2·s-1，光照时间16 h的条件下进行人工室内培养。培养1个月后，选择长势一致、健康的幼苗移植进行水培，再水培2个月后，进行试验处理。本试验设置4组处理：0 mmol/L NaCl为对照组，100、200和300 mmol/L NaCl为处理组，每个处理重复3次。分别在NaCl处理后第7天取样。

1.2 方 法

用锋利刀片取不同NaCl浓度处理的新鲜完整的宁夏枸杞叶片和幼根组织各15块(叶片取自同一部位的功能叶，幼根取自距离根尖3～5 mm处)，每块组织小于1 mm3。将叶片和幼根组织放入2.5%的戊二醛中固定3 h后，用0.1 mol/L磷酸缓冲液洗涤3次，每次15 min。浸入到1%锇酸中固定3 h，再用0.1 mol/L磷酸缓冲液洗涤3次，每次15 min。分别在10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%丙酮中依次各进行20 min脱水处理，然后在100%的丙酮中放置3次，每次30 min。100%丙酮+Epon812树脂(3∶1)室温放置2 h；100%丙酮+Epon812树脂(1∶1)室温放置4 h；100%丙酮+Epon812树脂(1∶3)室温过夜，整个过程需要封口并在摇床上进行。往包埋板内倒入少许包埋剂，将样品用牙签挑起一小块倒包埋板内在干燥器中放置12 h后，45 ℃烘箱内放置3 h，60 ℃烘箱内放置24 h。

将样品进行修块，用Leica EM UC6超薄切片机切片，然后用Leica DM500显微镜进行观察、定位和显微结构照相，最后经柠檬酸铅和乙酸双氧铀染色10 min，在日立H-7650透射电子显微镜下观察并照相。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫下宁夏枸杞叶肉细胞显微结构变化

宁夏枸杞叶片叶肉细胞分化为栅栏组织和海绵组织。对照组与100、200和300 mmol/L NaCl浓度下的显微结构相比，上表皮细胞排列紧密，形状不规则；栅栏组织呈长柱形，排列紧密(图版Ⅰ，1)；100 mmol/L NaCl处理下，上表皮细胞排列紧密，彼此嵌合，没有细胞间隙，形状不规则；栅栏组织呈长柱形，排列紧密(图版Ⅰ，2)；200 mmol/L NaCl处理下，上表皮细胞排列紧密，彼此嵌合，没有细胞间隙，形状不规则，上表皮细胞增厚；栅栏组织呈长柱形，排列紧密(图版Ⅰ，3)；300 mmol/L NaCl处理下，上表皮细胞排列紧密，彼此嵌合，没有细胞间隙，形状不规则，上表皮细胞增厚；栅栏组织与海绵组织已无明显区别，栅栏组织细胞出现缩短现象，形状由长柱状变为短圆柱状，排列疏松且紊乱(图版Ⅰ，4)。此外，100、200和300 mmol/L NaCl处理与对照组的显微结构相比，叶绿体数量和线粒体数量无明显变化(图版Ⅰ，1-4)。

图版Ⅰ NaCl胁迫下宁夏枸杞叶片和幼根显微结构变化U.上表皮细胞；L.下表皮细胞；P.栅栏组织；S.海绵组织；Ch.叶绿体；Epi.表皮；CO.皮层；EN.内皮层；xy.木质部。1. 0 mmol/L NaCl处理的叶片；2. 100 mmol/L NaCl处理的叶片；3. 200 mmol/L NaCl处理的叶片；4. 300 mmol/L NaCl处理的叶片；5. 0 mmol/L NaCl处理的幼根；6. 100 mmol/L NaCl处理的幼根；7. 200 mmol/L NaCl处理的幼根；8. 300 mmol/L NaCl处理的幼根Plate Ⅰ The microstructure changes of leaves and young roots of L. barbarum under salt stressU. Upper epidermal cells; L. Epidermal cells; P. Palisade tissue; S. Sponge tissue; Ch. Chloroplast; Epi. Epidermis; CO. Cortex; EN. Endodermis; xy. Xylem.1. 0 mmol/L NaCl-treated leaves; 2. 100 mmol/L NaCl-treated leaves; 3. 200 mmol/L NaCl-treated leaves; 4. 300 mmol/L NaCl-treated leaves;5. 0 mmol/L NaCl-treated young roots; 6. 100 mmol/L NaCl treated young roots; 7. 200 mmol/L NaCl treated young roots; 8. 300 mmol/L NaCl treated young roots

2.2 NaCl胁迫下宁夏枸杞幼根细胞显微结构变化

宁夏枸杞幼根的初生结构由表皮、皮层和维管柱组成，维管柱又分为中柱鞘、初生木质部和初生韧皮部。宁夏枸杞幼根表皮细胞排列整齐而紧密，无细胞间隙。皮层由薄壁细胞组成，在表皮下有一层或几层细胞，排列紧密，为外皮层，皮层的最内一层细胞为内皮层，内皮层细胞排列整齐、紧密。与对照组相比，100、200和300 mmol/L NaCl处理下，根的初生结构无明显变化，且结构完整(图版Ⅰ，5-8)。

2.3 NaCl胁迫下宁夏枸杞叶肉细胞超微结构变化

在无NaCl处理条件下，宁夏枸杞叶肉细胞中叶绿体形态饱满，结构完整，呈椭圆状，紧贴细胞膜分布成一排，叶绿体膜和类囊体结构清楚，基粒片层清晰可见，排列整齐。线粒体呈比较规则的球形或椭球形，形态饱满，双层膜结构清晰(图版Ⅱ，A1-A2)；100 mmol/L NaCl处理下，叶绿体形态饱满，结构完整，叶绿体膜和类囊体结构清楚，基粒片层清晰可见，排列整齐。线粒体呈球形或椭球型，大小不一，形态饱满，双层膜结构清晰(图版Ⅱ，B1-B2)；200 mmol/L NaCl处理下，部分叶绿体内类囊体膜发生解体，内部的基粒片层减少或膨胀，排列疏松，部分模糊不清，同时双层膜受到破坏，叶绿体不再紧贴细胞膜，出现大的空泡现象。线粒体形状发生改变，大小不一，双层膜结构清晰(图版Ⅱ，C1-C2)；300 mmol/L NaCl处理下，叶绿体结构发生变形，基粒片层排列紊乱，有轻微弯曲，而且破裂出现大的空泡，双层膜受到破环。线粒体形状大小不一，出现极少数空泡现象(图版Ⅱ，D1-D2)。此外，100，200和300 mmol/L NaCl处理与对照组的叶肉细胞超微结构相比，淀粉粒和嗜锇颗粒增多。

图版Ⅱ NaCl胁迫下宁夏枸杞叶片超微结构变化CW.细胞壁；Ch.叶绿体；Th.类囊体片层；OG.嗜锇颗粒；S.淀粉粒；Mi.线粒体。A1-A2. 0 mmol/L NaCl处理的叶片；B1-B2.100 mmol/L NaCl处理的叶片；C1-C2.200 mmol/L NaCl处理的叶片；D1-D2.300 mmol/L NaCl处理的叶片Plate Ⅱ Ultrastructural changes of L. barbarum leaves under NaCl stressCW. Cell wall; Ch. Chloroplast; Th. Thylakoid lamella; OG. Osmiophilic granule; S. Starch grain. Mi. Mitochondrion. A1-A2. 0 mmol/L NaCl-treated leaves; B1-B2.100 mmol/L NaCl-treated leaves; C1-C2. 200 mmol/L NaCl-treated leaves; D1-D2. 300 mmol/L NaCl-treated leaves

2.4 NaCl胁迫下宁夏枸杞幼根细胞超微结构变化

在无NaCl处理的宁夏枸杞幼根皮层薄壁细胞中，细胞核双层膜清晰可见，核基质丰富。线粒体分布在细胞膜周围，呈大小不一的椭球形或球形，结构完整，形态饱满，内膜上的嵴和双层膜清晰(图版Ⅲ，A1-A2)；在100 mmol/L NaCl处理下，细胞核双层膜清晰，核基质丰富。线粒体分布在细胞膜周围，呈椭球型，内膜上的嵴和双层膜清晰(图版Ⅲ，B1-B2)；在200 mmol/L NaCl处理下，细胞核双层膜解体，核基质有外溢现象。线粒体呈大小不一的球型，少数结构被破坏，双层膜较清晰，部分嵴模糊，出现空泡现象(图版Ⅲ，C1-C2)；在300 mmol/L NaCl处理下，细胞核解体，双层膜被破坏，核基质大量外溢，线粒体形状发生改变，内外膜模糊甚至破裂，大多数嵴模糊，出现空泡现象(图版Ⅲ，D1-D2)。

图版Ⅲ NaCl胁迫下宁夏枸杞幼根细胞超微结构变化CW.细胞壁；N.细胞核；Mi.线粒体.A1-A2. 0 mmol/L NaCl处理的幼根；B1-B2.100 mmol/L NaCl处理的幼根；C1-C2.200 mmol/L NaCl处理的幼根；D1-D2.300 mmol/L NaCl处理的幼根Plate Ⅲ Ultrastructural changes of young roots cells of L. barbarum under NaCl stressCW. Cell wall; N. Nucleus; Mi. Mitochondrion. A1-A2. 0 mmol/L NaCl-treated young roots; B1-B2. 100 mmol/L NaCl-treated young roots; C1-C2. 200 mmol/L NaCl-treated young roots; D1-D2. 300 mmol/L NaCl-treated young roots

3 讨 论

盐碱作为一种主要的逆境，对植物的生长发育具有显著影响，如生长受到抑制，叶绿素含量减少，脯氨酸含量增加，叶绿体和线粒体内部结构破坏等[14-16]。本研究结果表明，不同浓度的NaCl胁迫对宁夏枸杞叶片和幼根细胞的显微及超微结构影响不同，NaCl浓度大于200 mmol/L时，宁夏枸杞叶片和幼根细胞的超微结构发生了明显变化。

3.1 NaCl胁迫对宁夏枸杞叶片叶肉细胞结构的影响

不同盐浓度下，盐角草和盐爪爪等植物的叶肉质化，表皮细胞角质层增厚[17]。随着盐浓度的增加，木榄叶的上(下)角质层和上(下)表皮层逐渐增厚[18]。此外，叶肉细胞中栅栏组织纵向伸长可增加叶片对光能的捕获机会，从而适应盐胁迫环境[19]。在盐胁迫下，竹柳的栅栏组织厚度和角质层厚度在低盐浓度下其各值均呈现出最大值，随着盐浓度上升，其叶片栅栏组织排列较疏松且细胞长度变短[20]。在本研究中，无NaCl处理时，宁夏枸杞栅栏组织排列紧密且整齐，但随着NaCl浓度的增加，上表皮细胞增厚，栅栏组织出现缩短现象，由长柱状变为短圆柱状，排列疏松且紊乱，这与毛桂莲等[13]的研究结果基本一致，说明NaCl胁迫对宁夏枸杞叶的表皮和细胞栅栏组织产生了显著影响，且NaCl和NaHCO3胁迫都会引起栅栏组织紧密度降低的现象。

叶绿体作为植物光合作用的场所，完整的叶绿体结构是植物进行正常光合作用的前提，叶绿体的基粒片层数越多，排列越紧密，光合能力越强[21]。如果受到盐胁迫伤害，叶绿体的基粒片层破坏解体甚至消失时，会抑制光合作用的正常进行[22]，如盐胁迫下刺槐苗叶片中叶绿体排列和类囊体片层松散，形态肿大，导致叶片光合作用受到抑制[23]。在本研究中，100 mmol/L NaCl处理时叶绿体与对照组相差不大，叶绿体形态饱满，结构完整，呈椭圆状，基粒片层清晰可见，排列整齐，淀粉粒增多。但在200和300 mmol/L NaCl处理时，叶绿体内类囊体膜发生解体，基粒片层数目减少或膨胀，排列疏松，同时双层膜受到破坏，出现大的空泡现象，淀粉粒增多。这表明低浓度NaCl胁迫对宁夏枸杞叶片没有明显影响，而高浓度NaCl胁迫对宁夏枸杞叶片细胞叶绿体基粒片层具有损伤作用，可能会导致叶片光合作用受到抑制，光合能力下降。此外，高浓度NaCl胁迫下淀粉粒增多可能是因为淀粉粒作为重要的光合产物，可以水解释放能量，补充因胁迫造成的能量损失，这为宁夏枸杞具有较强耐盐碱性提供了结构方面的依据。此外，本研究发现随着盐胁迫浓度的加剧，叶肉细胞中线粒体的变化没有叶绿体的变化显著，这说明叶肉细胞中线粒体在盐胁迫环境下的受损较晚于叶绿体，这可能与叶片的呼吸作用有关，因为叶片受到胁迫后仍需要线粒体提供能量来转移营养物质[24]。因此，推测叶肉细胞中线粒体的耐盐性比叶绿体强。

3.2 NaCl胁迫对宁夏枸杞幼根细胞结构的影响

胁迫条件会破坏细胞的结构，最终会导致细胞生理功能减弱甚至丧失，是植物遭受逆境胁迫的机制之一[25-26]。在盐胁迫下，植物根的组织和细胞结构发生变化，且细胞中线粒体和细胞核的形态、结构、大小、数目及其分布也常因环境条件的变化而发生相应改变[27-28]，如盐胁迫下棉花的根内皮层凯氏带长度增加[29]。随着盐浓度的增加，小花碱茅根内皮层细胞壁明显增厚，且增厚的内皮层细胞壁在高浓度盐分下可以明显地帮助植物阻碍盐离子的进入[30]。Hans等[31]研究发现, 盐处理使高粱根内皮层细胞壁加厚, 导致根表皮细胞和皮层细胞线粒体的数量增加。正常情况下，棉花根系细胞中线粒体结构完整，膜清晰可见，但盐胁迫下，线粒体数量增多，膜系统受到破坏，内膜上的嵴减少甚至模糊[32]。在本研究中，100 mmol/L NaCl胁迫对宁夏枸杞幼根皮层薄壁细胞中线粒体没有明显影响，但随着NaCl胁迫的加重，线粒体形状发生改变，结构破坏，内外膜模糊甚至破裂，大多数嵴模糊，出现空泡现象，这表明高浓度NaCl胁迫导致线粒体内膜被损伤，氧化磷酸化体系被破坏，进而导致根细胞正常生理代谢受阻，而这种形态的改变可能是宁夏枸杞响应盐胁迫的重要生理反应之一。

细胞核作为遗传物质存在的主要部位，是细胞遗传和代谢活动的控制中心。逆境条件下，细胞核会发生相应的变化[33]。秦红艳等[34]发现盐处理下细胞核核膜解体或消失。而中度盐胁迫下，星星草中细胞核染色质高度凝缩，随着盐胁迫的加重，细胞核解体[35]。在本研究中，100 mmol/L NaCl胁迫下，细胞核核膜清晰，核基质丰富，但在200、300 mmol/L NaCl胁迫下，细胞核双层膜被破坏，核基质外溢，细胞核解体。因此，高浓度NaCl胁迫可能导致宁夏枸杞幼根皮层薄壁细胞核膜异常或受损，核内物质得不到正常的保护，细胞核的功能受到影响，从而影响到整个根系细胞的代谢活动。

综上所述，100 mmol/L NaCl胁迫对宁夏枸杞叶片和幼根的结构没有明显的影响，但高浓度NaCl胁迫可导致宁夏枸杞叶片和幼根细胞显微和超微结构发生明显变化，且随着NaCl浓度的增加，变化越明显。