土壤化学特性、酶活性和产量对农业措施的敏感性研究

邵兴华，Richard Dick

（1 上饶师范学院生命科学学院,江西上饶 334001；2 School of Environment and Natural Resources,The OhioState University,Columbus,OH 43210,USA）

健康及功能良好的土壤可改善水和空气的质量，支撑人类健康和提供宜居环境，以及维持动植物生产力，这对于确保全球人口不断增长的可持续性至关重要[1]。健康的土壤能够根据其自身固有的、动态变化的特性执行上述功能[2–3]。

人们很早就认识到土壤健康的重要性，最初使用土壤的颜色、味道、手感这些直观的感觉描述土壤状况和预测作物产量[4]。20世纪初，用定量指标，如作物产量、土壤无机养分含量开始取代“颜色、味道、手感”这些定性指标来评估土壤质量[5]；随着对土壤健康状况研究的深入，人们的注意力开始转向土地的可持续利用，研究者们普遍认为农业土壤质量不应该仅局限于产量目标[6–7]，由于土壤酶活性与土壤微生物的关系容易测定，以及对外来扰动的反应快速[8–9]，近些年土壤酶活性已经被用做土壤质量指标。

尽管已有多年的土壤质量指示指标的探索经验，但量化方面的研究工作仍在进行中。解释土壤健康的参数有很多，每项研究都侧重于少数指标以及它们如何对一种或两种干预措施做出反应，这种偶然的方法导致得出多种多样的结论[10]。与传统耕作方式相比，免耕显著增加土壤蛋白酶、β-葡萄糖苷酶的活性[11]。耕作强度降低对酶活性有无影响取决于当地的气候和土壤类型[12–13]。轮作与单作相比，轮作影响根际酶活性[14–16]，也有研究指出轮作对酶活性几乎没有影响[11]。目前许多土壤健康指标缺乏足够的数据敏感区分农业管理措施对土壤健康状况的影响[17]。

本研究选取3个长期试验站的土壤，农业管理措施包括耕作强度、作物轮作(或单作)、施肥(或不施肥)、覆盖物(有或无)，研究常用土壤质量指标土壤化学性质、产量、酶活性对农业管理措施的敏感性，为选择适合的对农业管理措施敏感的土壤质量评价指标提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验设计与样品采集

霍伊特维尔 (OHHO，始于1963年) 和伍斯特(OHWO，始于1962年) 分别位于美国俄亥俄州西北部和东北部。俄亥俄州的年平均气温为9.1℃，每年有173个无霜日，年平均降水量约905 mm[18]。OHHO试验点土壤质地为排水不畅的粉质粘壤土，OHWO试验点土壤质地为排水良好的淤泥质壤土[19]。俄勒冈州亚当斯(ORAD，始于1992年)试验点位于俄勒冈州亚当斯的Umatilla县，半干旱气候，年平均气温10.2℃，降水量420 mm，其中70%主要发生在10月16日至4月30日[20]。试验设计为随机区组设计(表1)，3个试验点的耕作制度一直延续至今。

2019年 5月在 OHHO、 OHWO、ORAD 3个长期实验站分别采集了0—15 cm耕层土壤样品。采用2.5 cm直径的土壤取样器采样，每种处理取约25个点，或足以提供不超过500 g的土样 (同一种处理几个重复间跨地块随机取样，以消除地块内的空间变异性)。将同种处理的混合样品放入耐用的拉链塑料袋中，做好标记。取样结束后样品袋放入冷藏容器中，随后运回实验室，暂时保存在4℃冰箱。土壤样品分成两部分，一部分样品保存在–20℃冷库，用来分析土壤酶；另一部分样品经自然风干后，测定土壤pH、全碳、全氮养分含量和土壤机械组成粘粒、砂粒、粉粒含量。

表1 试验地基本情况Table 1 Basic information of the experimental sites

1.2 土壤理化性状分析

土壤pH 测定采用土水比为 1∶2.5 浸提；土壤样品总氮和总碳，使用Leco C和N分析仪干烧法得到。土壤颗粒(砂粒、粉粒和粘粒)组成通过Bouyoucos液体比重计法测定[21]。

1.3 土壤酶活性分析

按照Tabatabai[22]的方法测定β-葡萄糖苷酶的活性，该方法利用pH 6.0的对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(PNG)缓冲液作为底物，底物加入土壤后在37℃下恒温共培养1 h，过滤得到滤液，用分光光度计420 nm测定黄色滤液的分光光度值。按照Tabatabai的方法测定芳基硫酸酯酶的活性，它的底物是pH 5.8的对硝基苯硫酸盐缓冲液。测定上述两种酶时，每个土样3次重复，同时做无土对照，由于培养时间短 (<2 h)，β-葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶的测定不使用甲苯。酶活性的计算以烘干土重为基础，酶活性单位用PNP mg/(g∙h)来表示，PNP为对硝基苯酚的英文缩写。

采用Zelles等[23]的方法测定二乙酸荧光素(3'，6'-二乙酰基荧光素) (FAD)的水解，称取1 g土壤，加20 mL 60 mmol/L 磷酸钠缓冲液 (pH 7.6) 于 125 mL锥形瓶中，在25℃的旋转振荡器上以100 r/min的速度振荡。15 min 后，加 100 μL FAD 溶液 (4.8 mmol/L)，并将悬浮液再振荡1.75 h，加20 mL丙酮终止反应。将该悬浮液在 4300 r/min 离心 5 min，Whatman No.4滤纸过滤分离滤液。分光光度计499 nm测定滤液的吸光度值。

作物产量由试验点提供，结果为5年产量的平均值。

1.4 统计分析

使用SAS 9.4软件进行方差分析(ANOVA)，用SNK进行差异显著性检验，分析不同处理间土壤化学性质(pH、全碳、全氮)及酶活性的差异显著性；同时使用SAS 9.4软件进行Pearson相关分析；用EXCEL制作相关图表。

2 结果与分析

2.1 土壤化学特性和产量的变化

在OHWO试验点，不同处理间pH无显著差异(表2)。OHHO试验点单作+不同耕作方式处理pH 为 CCC-MT > CCC-CT > CCC-NT；轮作+不同耕作方式处理 pH 为 COH-MT > COH-CT,COH-NT。同一种耕作方式+单作或轮作， CCC-CT与COH-CT,CCC-MT与COH-MT的pH无差异，COH-NT >CCC-NT。ORAD试验点不施肥+不同耕作方式+不同作物处理，WFa-CT、WFa-NT、PWY-NT 3种处理土壤pH无显著差异；施肥+不同耕作方式+不同作物处理，pH 为 PWY2-NT > WFa2-CT，WFa2-NT。同种耕作方式、相同作物+施肥或不施肥处理，pH分别为 WFa-CT >WFa2-CT，WFa-NT >WFa2-NT,PWY2-NT与PWY-NT处理pH无显著差异。

表2 OHHO、OHWO、ORAD 3个试验点不同处理土壤化学性质及产量Table 2 Chemical properties and yield of OHHO,OHWO,and ORAD experimental sites

OHHO、OHWO试验点土壤全氮、全碳、产量有相同的变化趋势。这2个试验点产量各处理间无显著差异，COH-NT处理全氮、全碳显著高于其他5个处理，因此免耕结合轮作 (COH-NT) 提高土壤全碳、全氮含量，对产量的影响不显著。ORAD试验点不施肥+不同耕作方式+不同作物处理，全碳含量为 WFa-NT,PWY-NT >WFa-CT；全氮含量为 PWYNT >WFa-NT >WFa-CT；WFa-NT 处理产量异常的低。 施肥+不同耕作方式+不同作物处理，土壤全碳、全氮为 PWY2-NT,WFa2-NT > WFa2-CT；产量为 WFa2-CT > PWY2-NT>WFa2-NT。同种耕作方式，相同作物+施肥或不施肥处理，全碳、全氮含量和产量为 WFa2-NT >WFa-NT，PWY2-NT >PWYNT，WFa-CT 与WFa2-CT处理全碳、全氮含量无显著差异，产量为WFa2-CT 处理>WFa-CT。

2.2 酶活性的变化

OHHO、OHWO 2个试验点，同一种作物不同耕作方式，β-葡萄糖苷酶活性均表现为COH-NT >COH-MT,COH-CT，而 CCC-NT、CCC-MT、CCCCT 无显著差异。同种耕作方式不同作物，在OHHO试验点，无论何种耕作方式下均为轮作>单作(COH-NT>CCC-NT，COH-CT>CCC-CT，COH-MT> CCCMT)；OHWO 试验点仅免耕+轮作>免耕+单作(P<0.05)，另外2种处理无显著差异(图1A)。

图1 OHHO,OHWO 试验点土壤β-葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶活性和荧光素二乙酸酯活性Fig. 1 The activities of soil β-glucosidase,arylsulfatase,and fluorescein diacetate at OHHO and OHWO sites

OHHO 试验点，芳基硫酸酯酶，同一种作物不同耕作方式为 COH-NT > COH-CT > COH-MT 和CCC-NT > CCC-MT,CCC-CT；同种耕作方式不同作物，芳基硫酸酯酶活性轮作>单作(COH-NT > CCCNT,COH-MT > CCC-MT,COH-CT > CCC-CT)。OHWO 试验点无论同种耕作方式不同作物或同一种作物不同耕作方式，轮作与免耕配合的芳基硫酸酯酶活性最高(图1B)。

OHHO试验点，荧光素二乙酸酯活性，轮作配合免耕处理(COH-NT )显著大于其他5种处理；OHWO试验点荧光素二乙酸酯活性最高的是COHNT处理,最低的是CCC-MT和COH-MT处理(图1C)。

从表3可知，ORAD试验点β-葡萄糖苷酶活性，轮作+覆盖物+施肥+免耕处理(PWY2-NT )>轮作+覆盖物+免耕处理( PWY-NT)>轮作+施肥+深耕处理(WFa2-CT)>小麦–休闲施肥或不施肥配合免耕以及小麦–休闲配合深耕处理(WFa2-NT,WFa-NT,WFa-CT)。荧光素二乙酸酯活性为轮作+覆盖物+免耕处理(PWY-NT)最高，其次为轮作+覆盖物+施肥+免耕处理(PWY2-NT)，最低的为小麦–休闲配合深耕处理(WFa-CT)。芳基硫酸酯酶活性为PWY2-NT处理显著高于PWY-NT、WFa2-NT、WFa-CT处理，芳基硫酸酯酶活性最低的是WFa-CT、WFa2-NT处理。

表3 ORAD试验点3种酶活性的变化[μg/(g∙h)]Table 3 Three enzyme activities at ORAD site

2.3 不同试验点土壤化学特性、酶活性、产量间的相关分析

相关分析结果(表4)表明，OHHO、OHWO 2个试验点全碳与全氮、β-葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶，全氮与β-葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶及β-葡萄糖苷酶与芳基硫酸酯酶相关性达 5% 或 1% 水平。ORAD试验点芳基硫酸酯酶与全碳、全氮、β-葡萄糖苷酶相关性没有达到 5% 显著性水平；全碳与全氮、β-葡萄糖苷酶及全氮与β-葡萄糖苷酶相关性达到了显著或极显著水平。OHWO 试验点产量与β-葡萄糖苷酶活性显著负相关；ORAD试验点产量与β-葡萄糖苷酶活性显著正相关；在OHHO、ORAD 2 个试验点，产量与pH显著负相关。

表4 OHHO、OHWO、ORAD 3个试验点土壤化学特性、酶活性、产量相关系数矩阵Table 4 Correlation coefficient matrix of soil chemical properties,enzyme activities,and yield in OHHO,OHWO,ORAD experimental sites

3 讨论

pH是非常重要的土壤特性，特别是在全球范围内，土壤pH清晰地反映了各地的气候情况，被认为是土壤细菌群落组成和多样性的重要指示者[24–25]。本研究中，OHHO、ORAD试验点的研究结果表明，轮作、单作、耕作强度影响土壤pH，而OHWO试验点轮作、单作、耕作强度对pH值的影响为处理间差异不显著。ORAD试验点的3个不施肥处理(WFa-CT、WFa-NT、PWY-NT) pH 差异不显著，除PWY2-NT外施氮肥降低土壤pH，3个施肥处理中PWY2-NT的pH与不施肥处理WFa-CT、PWYNT差异不显著，是因为覆盖物的使用可以某种程度上缓解施氮肥引起的土壤pH降低趋势，本研究结果与其他研究者[26–27]的结论一致。

ORAD试验点，施肥处理PWY2-NT、WFa2-NT全氮、全磷含量显著高于不施肥处理WFa-NT，PWY2-NT处理全氮、全磷含量显著高于WFa-CT处理。不施肥处理WFa-NT、PWY-NT全氮、全碳含量显著高于WFa-CT。免耕(NT)结合轮作土壤全碳含量大于传统耕作(CT)结合作物轮作，与CT相比，NT增加土壤中全碳主要是由于作物残留物在土壤表面的积累，从而导致土壤湿润、凉爽，使氧化性降低从而有利于有机质的累积[27]。Kennedy等[28]指出保护性耕作免耕，植物残留在土壤表面可能阻碍幼苗萌发进而影响产量，同时这种地块易发生病虫害，或降低养分移动性。全碳(或有机质)、产量常作为土壤质量的评价指标，产量易因病虫害或某一年突发气候条件的影响，评价指标应具有稳定性，从这点来看，全碳比产量对外来扰动更具稳定性。

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)与纤维素的降解、葡萄糖的释放、碳循环有关，β-葡萄糖苷酶是一种极其重要的微生物能量源。芳基硫酸酯酶(arylsulfatase)参与土壤中含硫化合物的代谢、循环，它有助于植物有效SO42−的释放，它也可能是真菌生物量的间接指示者，因为只有真菌(不是细菌)含有芳基硫酸酯酶的底物硫酸酯。荧光素二乙酸酯(FDA)水解受许多酶(脂肪酶、蛋白酶、酯酶)的催化,荧光素二乙酸酯测定是集成酶的广谱测定，荧光素二乙酸酯的多寡与微生物的活性和抑制土壤植物病害有关[29]。

作物轮作配合免耕(NT) β-葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶和荧光素二乙酸酯活性显著高于作物轮作配合 CT、MT 或单作与 3 种耕作方式 (NT,CT,MT)配合后的酶活性。众所周知，耕作改变土壤结构，使更多的有机物接受微生物的作用，而免耕则促进大团聚体的形成和稳定，这是保护和维持土壤有机质的重要机制。免耕对土壤的干扰小，与作物轮作相结合可保护土壤免于持续性的退化[30]。Roldán等[31]的研究表明保护性耕作(免耕和减少耕作)与常规耕作相比，土壤具有更高的β-葡萄糖苷酶、磷酸酶和团聚体稳定性，因此，免耕是改善土壤物理性状和提高土壤生化质量的有效办法。轮作改变了土壤生境，原因在于轮作作物吸收的养分、作物根深、土壤中残留物与残留量及其成分不同。与单一栽培(单作)相比，轮作显著增加土壤生物多样性和生物活性，单作加速土壤有机碳(SOC)的分解[32]，增加土壤侵蚀和地表径流，破坏土壤团聚体结构[33]。免耕和轮作是最佳的农业土壤管理方式[31]，它扩大了碳和养分循环库，增加了酶的活性[32]。特别是β-葡萄糖苷酶活性的增加，使残留物分解增加，增加了后续作物的有效性养分。

研究已发现β-葡萄糖苷酶对农业管理措施很敏感[34–35]，β-葡萄糖苷酶活性的变化比总有机碳的变化更容易检测[8,36]，已经被建议作为土壤质量的指示指标[37]。比较β-葡萄糖苷酶活性、全碳发现，β-葡萄糖苷酶可以区分轮作条件下常规耕作(COH-CT)与免耕(COH-NT)之间的差异，也能区分单作条件下免耕、深耕和浅耕处理间的差异，在ORAD试验点，β-葡萄糖苷酶可以区分麦豆轮作条件下，施肥(PWY2-NT)与不施肥(PWY-NT)二个处理; 区分小麦–休闲在常规耕作制度下，施肥(WFa2-CT)与不施肥(WFa-CT)二个处理间的差异，而土壤全碳含量不能区分这些处理间的差异性，所以β-葡萄糖苷酶对外来扰动更敏感，是更敏感的土壤质量指示者。

相关分析结果(表4)表明，当把 3个试验点看成是一个大的试验点后，各个项目间的相关性增强，特别是β-葡萄糖苷酶，除了与pH的相关性没有达到显著性水平外，与其他各个项目的相关性均达到了显著或极显著水平。再次证实了β-葡萄糖苷酶与其他土壤质量指标关系密切，且对外来扰动敏感，是更敏感的土壤质量指示指标。

4 结论

土壤化学特性、产量和酶活性均受耕作强度、轮作(或单作)、施肥、覆盖物的影响，β-葡萄糖苷酶对这些措施的反应稳定且敏感性大于全碳含量，也大于产量。β-葡萄糖苷酶与土壤全碳、全氮含量相关极显著，因而是土壤肥力的可靠评价指标。依据该指标，轮作配合免耕是值得推荐的农业管理措施。