乳酸菌发酵鸭梨汁工艺优化及风味研究

李栋，牟德华，郭逸，王光亚

（河北科技大学食品与生物学院，河北 石家庄 050018）

鸭梨富含糖、有机酸、维生素等营养物质，具有润燥化痰、润肠通便、养阴清热、促进消化等功效[1-2]。乳酸菌在发酵过程中产生酸、多酚类物质等多种功效成分，其中乳酸具有调节胃肠道功能、提高免疫能力、抑制有害菌等作用[3-4]。乳酸菌发酵过程可以提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶活力，SOD 具有抗氧化作用。发酵后的鸭梨汁含酸量增加、并具有特有的乳酸菌代谢物质和风味特征[5-6]，更容易被人体吸收[7-9]。

周印等[10]以植物乳杆菌299、保加利亚乳杆菌717和嗜热链球菌176混合发酵鸭梨汁，发酵后鸭梨汁口感突出，风味酸甜，发酵后有机酸含量提高。黄滢洁等[11]以植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵鸭梨汁，优化了发酵鸭梨汁的生产工艺。Ankolekar等[12]利用嗜酸乳杆菌发酵鸭梨汁，通过体外试验对发酵产物进行功能性研究。本研究以鸭梨为原料，自选戊糖片球菌与乳双歧杆菌HN019按体积比1∶1混合作为发酵剂，进行鸭梨汁发酵工艺优化，并对产品的有机酸和挥发性香气物质进行分析测定，以VC为参照，研究其体外抗氧化功能，为鸭梨开辟新的加工途径和产品奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸭梨：市售，河北省晋州地理标志保护产品，形态完好，无损伤。

乳酸菌：自选戊糖片球菌（Leuconostoc fallax，LF）分离自羊羔美酒大曲，Genbank登录号KC454281；乳双歧杆菌（Bifidobacterium）HN019（BF）：江苏省江阴新申奥生物科技有限公司。

蛋白胨、酵母提取物（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限公司；牛肉膏（生化试剂）、MgSO4·7H2O（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；葡萄糖、过氧化氢（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂开发中心；CH3COONa·3H2O、水杨酸（均为分析纯）：天津市标准科技有限公司；KH2PO4、MnSO4·H2O、无水乙醇（均为分析纯）：天津市永大化学试剂厂；柠檬酸三铵（分析纯）：天津市百世化工有限公司；吐温80（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；NaOH（分析纯）：天津市大陆化学试剂厂；2，2′-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海宝曼生物科技有限公司；FeSO4（分析纯）：天津市四通化工厂。

1.2 仪器与设备

DH300电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；PL203电子天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；Delta320型pH计：深圳市凯铭杰仪器设备有限公司；SW-CJ-1FDA超净台：北京华威中仪科技有限公司；DK-98-1电热恒温水浴锅、DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：河南省巩义市英峪予华仪器厂；7820-5975C气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪、HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美国安捷伦公司；LC-20A高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）：日本岛津公司；ODSC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：迪马科技有限公司；手动固相微萃取手柄、磁子及二乙烯基苯-羧乙基-聚二甲基硅氧烷萃取头：美国Sigma公司。

1.3 试验方法

1.3.1 单因素试验

将鸭梨切块榨汁，过滤残渣，收集鸭梨汁。以发酵鸭梨汁中含酸量和SOD酶活力为考察指标，固定因素为菌液接种量（戊糖片球菌∶乳双歧杆菌HN019=1∶1，体积比）3%、加糖量6%、32℃发酵3 d。考察菌液接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、加糖量（2%、4%、6%、8%、10%）、发酵时间（1、2、3、4、5 d）、发酵温度（24、28、32、36、40℃）对含酸量和SOD酶活力的影响。

1.3.2 响应面优化试验

在单因素试验基础上，采用Box-Behnken响应面试验设计[13-15]，以发酵鸭梨汁含酸量与SOD酶活力为响应值，因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平设计Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.3 理化指标测定

含酸量参考GB/T 12456—2021《食品中总酸的测定》[16]中方法测定。

SOD酶活力参考GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定》[17]中方法测定。

1.3.4 有机酸的测定

1.3.4.1 标准品的制备

分别配制单标原液，浓度为草酸5g/L、酒石酸25g/L、DL-苹果酸60 g/L、柠檬酸50 g/L、丙酮酸40 g/L、乳酸600 g/L、乙酸700 g/L、琥珀酸50 g/L。乳酸、乙酸各取0.1mL，琥珀酸取2 mL，其余5种有机酸各取1 mL混合，用水定容至10mL，所得溶液为有机酸混标溶液。

1.3.4.2 样品预处理

将样品以4 000 r/min，离心10 min，0.45 μm微孔滤膜过滤上清液2次。

1.3.4.3 测定条件

流动相A：pH=2.9，0.02 mol/L磷酸二氢铵；流动相B：100%乙睛。A∶B=98∶2（体积比），流速 0.5 mL/min，柱温30℃，进样量20 μL，于213 nm检测。梯度洗脱程序为 0～15.02 min，98%～98.2%A、2%～1.98%B；15.02 min～22.50 min，98%A、2%B。

1.3.5 顶空固相微萃取测定挥发性香气物质

1.3.5.1 挥发性香气物质的萃取

挥发性香气物质萃取采用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HP-SPME）法[18]提取发酵鸭梨汁中的挥发性香气物质。取5 mL试样，加入2 g干燥的NaCl，密封置于50℃水浴中平衡15 min。推手柄使纤维头伸出针管萃取吸附30 min，取出手柄直接进样，250℃下解吸3 min。

1.3.5.2 挥发性香气物质的测定

色谱条件[19-20]：载气为氦气，流速1.0 mL/min；升温程序：40℃保持12 min，以3℃/min升至108℃保持2 min，再以5℃/min升至250℃保持5 min，进样口温度250℃。质谱条件：离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电离方式为EI，电子能量70 ev；扫描质量范围为 45 amu～550 amu。

1.3.5.3 挥发性香气物质定性与定量

定性分析：采用气相色谱质谱联用仪自带质谱数据库，并通过检索和查阅相关文献作为参考[21]。

定量分析：采用内标法，内标物为2-辛醇（389mg/L），计算公式如下。

式中：W为挥发性风味化合物质量浓度，mg/L；F为加入内标物质量，mg；A为待测组分的峰面积；B为内标物的峰面积；G为待测组分对内标物的质量相对校正因子。

1.3.6 发酵鸭梨汁抗氧化性的测定

1.3.6.1 VC浓度的配制

配制浓度为1.4 mg/L VC，将其稀释成0.1 mg/mL～1.4 mg/mL。分别与 DPPH·、ABTS+·、羟基自由基清除率作对照。

1.3.6.2 鸭梨汁样品处理

各称取160 mg发酵前、后的鸭梨汁，用去离子水定容到10 mL，配成浓度为16 mg/mL的鸭梨汁，稀释成2 mg/mL～16 mg/mL用于试验操作。

1.3.6.3 抗氧化试验

根据孙鹏尧[22]的方法，测定DPPH自由基和ABTS+自由基清除率。根据韩秋菊等[23]的方法，测定羟基自由基清除率。

1.3.7 感官评价

由10名受过训练的老师和学生组成感官评定小组，从色泽、组织状态、气味、滋味、口感5个方面对发酵前后的鸭梨汁进行感官评价，评分标准如表2所示。

表2 鸭梨汁感官评分标准Table 2 Sensory scoring standards for pear juice

1.4 数据处理

所有试验均重复3次，用Origin 8.0作图，使用SPSS 19.0进行数据显著水平分析，p＜0.05，表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 发酵鸭梨汁单因素试验结果

2.1.1 接种量对发酵鸭梨汁含酸量和SOD酶活力的影响

接种量对发酵鸭梨汁含酸量和SOD酶活力的影响见图1。

图1 接种量对发酵鸭梨汁含酸量和SOD酶活力的影响Fig.1 The effect of inoculum on acid production and SOD enzyme activity of fermented pear juice

由图1可知，当接种量1%～3%时，发酵鸭梨汁里的含酸量和SOD酶活力逐渐增大，原因可能是随着接种量增加，乳酸菌将鸭梨汁中的营养成分转换成酸，提高了发酵鸭梨汁的含酸量和SOD酶活力；当接种量为3%时，发酵鸭梨汁中的含酸量和SOD酶活力达到最大，分别为6.21 g/kg和375.68 U/mL；当接种量超过3%时，含酸量和SOD酶活力下降，可能是因为菌量过高，营养物质消耗殆尽，导致发酵鸭梨汁中的含酸量和SOD酶活力下降。因此，选取接种量为2%、3%、4%进行响应面试验设计。

2.1.2 加糖量对发酵鸭梨汁含酸量和SOD酶活力的影响

加糖量对发酵鸭梨汁含酸量和SOD酶活力的影响见图2。

图2 加糖量对发酵鸭梨汁含酸量和SOD酶活力的影响Fig.2 The effect of the amount of sugar added on the acid production and SOD enzyme activity of fermented pear juice

由图2可知，随着加糖量的增加，发酵鸭梨汁含酸量和SOD酶活力均呈先上升后下降的趋势。加糖量为6%时，含酸量和SOD酶活力达到高峰，加糖量继续增加，发酵鸭梨汁含酸量与SOD酶活力逐渐下降，原因可能是高浓度糖分抑制乳酸菌。因此，选取加糖量为4%、6%、8%进行响应面试验设计。

2.1.3 发酵时间对发酵鸭梨汁含酸量和SOD酶活力的影响

发酵时间对发酵鸭梨汁含酸量和SOD酶活力的影响见图3。

图3 发酵时间对发酵鸭梨汁含酸量和SOD酶活力的影响Fig.3 The effect of fermentation time on the acid production and SOD enzyme activity of fermented pear juice

由图3可知，当发酵3 d时，发酵鸭梨汁发酵含酸量和SOD酶活力达到最大值，继续延长发酵时间，其含酸量和SOD酶活力下降，可能是发酵鸭梨汁中的营养物质被消耗导致乳酸菌活力下降，间接影响鸭梨汁中含酸量和SOD酶活力。因此，选取发酵时间为2、3、4 d进行响应面试验设计。

2.1.4 发酵温度对发酵鸭梨汁含酸量和SOD酶活力的影响

发酵温度对发酵鸭梨汁含酸量和SOD酶活力的影响见图4。

图4 发酵温度对发酵鸭梨汁含酸量和SOD酶活力的影响Fig.4 The effect of fermentation temperature on the acid production and SOD enzyme activity of fermented pear juice

由图4可知，在24℃～36℃时，发酵鸭梨汁含酸量随发酵温度的升高而增大，发酵温度为36℃时，含酸量达到最大值。在24℃～32℃时，发酵鸭梨汁的SOD酶活力随发酵温度的升高而增大。发酵温度为32℃时，SOD酶活力达到最高峰；SOD酶活力在32℃和36℃相差不大，因此选取发酵温度为28、32、36℃进行响应面试验设计。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计与结果

以接种量、加糖量、发酵时间、发酵温度为因素，含酸量和SOD酶活力为响应值进行发酵鸭梨汁优化试验。响应面Box-Behnken试验设计及结果见表3。

表3 响应面Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Response surface Box-Behnken test design and results

利用Design Expert 8.0.6软件分析得到含酸量（X1）和 SOD 酶活力（X2）对自变量 A（接种量）、B（加糖量）、C（发酵时间）、D（发酵温度）的回归方程如下。

X1=6.30-0.028A+0.14B-0.16C-0.14D+0.063AB-0.058AC-0.04AD-0.32BC+0.32BD-0.11CD-0.16A2-0.47B2-0.22C2-0.89D2。

X2=343.93+0.27A-2.91B-3.38C-3.53D+12.73AB-21.84AC+2.17AD+10.05BC-8.27BD-7.6CD-6A2-29.06B2-14.75C2-29.88D2。

含酸量和SOD酶活力方差分析见表4和表5。

表4 含酸量方差分析Table 4 Variance analysis of acid production

表5 SOD酶活力方差分析Table 5 Analysis of variance of SOD enzyme activity

由表4和表5可知，两个模型均达显著水平（P＜0.05），且失拟项不显著（P＞0.05），表明方程与实际数据拟合性良好，试验设计可靠，适用于发酵鸭梨汁工艺参数的优化。在方差分析表中用F值来衡量该因素对含酸量和SOD酶活力的影响，F值越大其影响程度也越明显，P值越小其影响程度越明显。影响发酵鸭梨汁含酸量的因子主次顺序为发酵温度＞发酵时间＞加糖量＞接种量，且 B2对模型影响显著（P＜0.05），D2对模型影响极显著（P＜0.01）。影响发酵鸭梨汁SOD酶活力的因子主次顺序为发酵时间＞发酵温度＞加糖量＞接种量，且 AC、B2、D2对模型影响显著（P＜0.05）。

2.2.2 因素交互分析

各因素交互分析结果见图5和图6。

图5 各因素交互作用对含酸量的响应面图Fig.5 Response surface diagram of the interaction of various factors on acid production

图6 各因素交互作用对SOD酶活力的响应面图Fig.6 Response surface diagram of the interaction of various factors on SOD enzyme activity

由图5可知，A与D、B与C、B与D、C与D交互作用的三维图较陡，曲面变化较为明显，等高线图呈椭圆形，说明A与D交互作用、B与C交互作用、B与D交互作用和C与D交互作用对发酵鸭梨汁的含酸量影响较大。A与B交互作用三维图坡面较陡，但变化不显著，故加糖量与接种量的交互作用对发酵鸭梨汁含酸量的影响并不明显。

由图6可知，B与D交互作用的三维图较陡，曲面变化较为明显，等高线图呈椭圆形，说明B与D交互作用对发酵鸭梨汁SOD酶活力的影响较大。发酵时间的曲线变化幅度较大，说明该因素对发酵鸭梨汁SOD酶活力的影响较大；A与C交互作用三维图坡面较陡，但变化不显著，故发酵温度与接种量的交互作用对发酵鸭梨汁SOD酶活力的影响并不明显。

2.2.3 验证试验

通过响应面设计试验结果分析，鸭梨汁发酵最佳工艺条件为接种量3.46%、加糖量6.23%、发酵温度30.21℃、发酵时间2.98 d，含酸量和SOD酶活力分别达到6.32g/kg和345.3U/mL。考虑到实际操作，将优化后的发酵条件修正为接种量3.5%、加糖量6%、发酵温度30℃、发酵时间3d，试验结果得到含酸量为6.35g/kg，SOD酶活力为345.65 U/mL。与预测值相近，表明试验结果与该模型拟合度较好。因此，通过响应面分析法优化得到的酸菌发酵鸭梨工艺条件准确可靠，参考性较高。

2.3 发酵鸭梨汁有机酸成分分析

发酵鸭梨汁有机酸成分分析结果见表6。

有机酸可以维持人体正常的生理活动，具有修复人体病变器官的效果等[24-30]。由表6可知，发酵前鸭梨汁的有机酸主要以柠檬酸为主，占总酸51.1%，发酵后主要是乳酸和乙酸，从发酵前占总酸含量的12.6%和12.1%提高到41.2%和40.6%。乳酸的变化与潘勇等[31]的研究结果一致，发酵过程中乳酸菌将大量的柠檬酸转变成乳酸和乙酸。

表6 有机酸含量测定结果Table 6 Results of determination of organic acid content before and after fermentation

2.4 发酵鸭梨汁挥发性香气物质分析

发酵鸭梨汁挥发性香气物质分析结果见表7。

表7 发酵鸭梨汁挥发性香气物质分析Table 7 Analysis of volatile aroma substances in fermented pear juice

续表7 发酵鸭梨汁挥发性香气物质分析Continue table 7 Analysis of volatile aroma substances in fermented pear juice

由表7可知，发酵后挥发性香气物质种类和数量均明显增加，主要挥发性香气物质种类由17种增加到28种，含量提高8.5倍。以醇类物质含量变化最大，由0.72 μg/L增加到62.80 μg/L，苯乙醇含量最高，达到33.57 μg/L。其次是酯类物质含量发酵后较发酵前有所增加，且多数酯类具有花果香气，极大地增加了发酵后鸭梨汁独特的风味，如癸酸乙酯，其具有梨和白兰地的香韵[32]，含量最大达19.88 μg/L；辛酸乙酯具有令人愉快的花果香气、杏子香气[33]；乙酸苯乙酯具有令人愉悦的花香[34]。酚类物质总量由0.54 μg/L增加至2.19 μg/L，酚类物质提高了发酵鸭梨汁的抗氧化性。

2.5 体外抗氧化性结果分析

2.5.1 DPPH自由基清除率的测定

DPPH自由基清除率的测定结果见7。

由图7可知，以VC为参照，随着VC浓度的增加DPPH自由基清除率提高，发酵鸭梨汁浓度达到12 mg/mL时，DPPH自由基清除率达到最高值，与VC的DPPH自由基清除率最高值接近，达到80.46%，相对于鸭梨汁提高26.63%。可见鸭梨汁经过乳酸菌发酵，分解鸭梨汁中的营养成分，促使酚类物质含量上升，提高了DPPH自由基清除率。

图7 VC与样品DPPH自由基清除率Fig.7 Vitamin C and DPPH scavenging ability of the sample

2.5.2 ABTS+自由基清除率的测定

ABTS+自由基清除率的测定结果见图8。

图8 VC与样品的ABTS+自由基清除率Fig.8 Vitamin C and the ABTS+scavenging ability of the sample

由图8可知，以VC为参照，VC浓度0.6 mg/mL时的ABTS+自由基清除率为85.53%。发酵鸭梨汁浓度为12 mg/mL时，ABTS+自由基清除率达到78.71%，浓度为12 mg/mL的鸭梨汁ABTS+自由基清除率为60.35%。可知发酵鸭梨汁比鸭梨汁的ABTS+自由基清除率提高了17.18%。

2.5.3 羟基自由基清除率的测定

羟基自由基清除率的测定结果见图9。

图9 VC与样品的羟自由基清除率Fig.9 Vitamin C and the hydroxyl radical scavenging ability of the sample

由图9可知，发酵鸭梨汁在不同浓度下羟基自由基清除率均高于鸭梨汁，说明在发酵过程中，乳酸菌提高了鸭梨汁的羟基自由基清除率。以VC为参照，0.35 mg/mL的VC羟基自由基清除率为80.34%，发酵鸭梨汁浓度为14 mg/mL，羟基自由基清除率达到最高值72.63%，与发酵前的60.35%相比有明显的提高。

2.6 感官评价结果

发酵鸭梨汁经品尝综合得分为81.5分，较发酵前的鸭梨汁高10.5分。感官评价结果雷达图见图10。

由图10可知，发酵鸭梨汁在色泽、气味、滋味和口感方面均比未发酵的鸭梨汁得分高，发酵后鸭梨汁的色泽呈禾杆黄色，具有浓郁的果香和发酵香，滋味协调，风味突出，并具有鸭梨发酵特有的口感，酸甜适度。各项理化指标符合QB/T5356—2018《果蔬发酵汁》要求。

图10 发酵前后鸭梨汁的感官评价雷达图Fig.10 Sensory evaluation radar chart of pear juice before and after fermentation

3 结论

在单因素试验基础上进行了Box-Behnken优化试验，得到混合菌发酵鸭梨汁最佳工艺条件为混合乳酸菌接种量3.5%、加糖量6%、30℃发酵3 d，发酵鸭梨汁含酸量6.35 g/kg，SOD酶活力345.65 U/mL，以乳酸和乙酸为主体有机酸和以苯乙醇、异戊醇和葵酸乙酯为主体挥发性香气物质。DPPH自由基、ABTS+自由基和羟基自由基清除率最高分别达到80.46%、78.71%和72.63%。为鸭梨深加工和工业开发奠定了基础。