对氧磷酶1基因位点多态性与川崎病的关系研究*

陈芳，王曼知，危松青，李嘉，石家云，张小佛

（南华大学附属长沙中心医院 儿科，湖南 长沙410004）

川崎病（Kawasaki disease, KD）是一种急性发热性、血管炎症疾病，最常累及冠状动脉，是儿童后天获得性心脏病的主要原因之一。虽然从日本学者首次发现KD 至今已有50 多年的历史，但KD及其引起的心血管并发症的发病机制仍未完全阐明，可能与氧化应激有关。氧化应激可损伤血管内皮细胞功能，引起内皮下层及中膜组织变薄，导致血管紧张度降低及远期心血管事件的发生[1-2]。氧化应激是一种由各种原因所致的氧化和抗氧化的失衡状态，在KD 及其并发冠状动脉损害的发病机制中有重要作用[2]。而对氧磷酶1（Paraoxonase-1,PON1）是一种抗氧化酶，在维持体内氧化-抗氧化平衡中起关键作用。国内外研究[3-4]发现，PON1 部分基因多态性与全身氧化应激和心血管事件相关，但有关PON1 与KD 及其并发冠状动脉损害的关系研究甚少。本研究选取PON1基因多态性的位点rs662、rs3917541、rs3917539，探讨PON1基因位点多态性与KD 及其并发冠状动脉损害的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2013年1月—2018年12月在南华大学附属长沙中心医院儿科住院的93 例KD 患儿（KD 组），男∶女为1.58∶1，年龄2 个月～7 岁。纳入标准：①所有患儿均符合KD 诊断标准[5]；②年龄≤14 岁；③入院前均未使用丙种球蛋白及阿司匹林治疗；④能接受规律门诊复诊。排除标准：①临床资料不完善；②既往有KD、感染性疾病、心血管疾病、风湿免疫性疾病史。根据超声心动图结果，KD 组又分为合并冠状动脉损害组（15 例）和未合并冠状动脉损害组（78 例）。KD 合并冠状动脉损害的诊断标准[5]：Z 值＜2，为无受累；2 ≤Z 值＜2.5，或初始Z 值＜2、随访时Z 值下降幅度≥1，为仅扩张；2.5 ≤Z 值＜5，为小型冠状动脉瘤；5 ≤Z 值＜10，同时内径绝对值＜8 mm，为中型冠状动脉瘤；Z 值≥10 或内径绝对值≥8 mm，为巨大冠状动脉瘤。选取同时间段在该院体检的94 例正常儿童为对照组，男∶女为1.69∶1，年龄3 个月～9 岁。排除既往KD、感染性疾病、心血管疾病、风湿免疫性疾病等病史。本研究经医院医学伦理委员会批准，患儿监护人均签订知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 提取基因组DNA 采用含5%的EDTA-Na2抗凝剂的一次性采血管，抽取所有研究对象的外周静脉血2 mL，置于-80℃冰箱冷冻保存。应用DNA 试剂盒（美国Promega 公司）提取血液标本中的基因组DNA，并测定其浓度和纯度，合格样本置于-80℃冰箱冷冻保存。

1.2.2 基因多态性检测 从PubMed 网站GenBank系统中查询PON1基因的碱基序列，采用Premier 5.0 软件设计包含PON1基 因rs662、rs3917541、rs3917539 位点的PCR 扩增特异性引物。应用聚合酶链反应-直接测序法（PCR-SBT）检测所有研究对象PON1基 因rs662、rs3917541、rs3917539 位点的基因型。引物序列由擎科生物技术有限公司合成，正向5'-GTATCCAGGCTGCTGGTTCA-3'，反向5'-CGAGTGGTGGCAGAAGGATT-3'。PCR 反应体系为25 μL：模 板DNA 2.0 μL，正向引物0.5 μL（10 μmol/L），反向引物0.5 μL（10 μmol/L），2×Taq PCR Green Mix 12.5 μL，去离子水9.5 μL。采用美国ABI PCR 9700 扩增仪（上海赛默生物科技发展有限公司）进行扩增。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 个循环，72℃终末延伸10 min。扩增产物行琼脂糖凝胶电泳后，于紫外灯下照相并记录电泳图谱，扩增成功的PCR 产物由长沙贝博生物科技有限公司进行基因测序。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0 统计软件。采用Hardy-Weinberg 遗传平衡定律检验组间基因型频率平衡吻合度； 以直接计数法计算PON1基因rs662、rs3917541、rs3917539 位点各种基因型频率和等位基因频率；计数资料以百分比表示，比较采用χ2检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PON1基因的PCR扩增产物

采用PCR 扩增PON1基因，该产物为618 bp，结果与预期一致。见图1。

图1 PON1基因PCR扩增产物电泳图

2.2 PON1基因rs662位点多态性

PON1基因rs662 位点多态性表现为A 突变为G，AA 型、AG 型、GG 型均可见。见图2。

图2 PON1基因rs662位点测序图

2.3 PON1基因rs3917541位点多态性

PON1基因rs3917541 位点多态性表现为C 突变为T，CC 型、CT 型、TT 型均可见。见图3。

图3 PON1基因rs3917541位点测序图

2.4 PON1基因rs3917539位点多态性

PON1基因rs3917539 位点多态性表现为TT 型（插入型）、--（缺陷型）、-/T 型（缺陷/插入型）均可见。见图4。

图4 PON1基因rs3917539位点PCR产物测序图

2.5 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

采用Hardy-Weinberg 遗传平衡定律检验组间基因型频率平衡吻合度。KD 组PON1基因rs662、rs3917541、rs3917539 位点基因型频率分布（χ2=0.036、0.001 和0.020，P=0.981、0.999 和0.990），对 照 组PON1基 因rs662、rs3917541、rs3917539 位点基因型频率分布（χ2=0.118、0.187 和0.009，P=0.942、0.910 和0.995），均 符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律，具有群体代表性。

2.6 PON1 基因rs662、rs3917541、rs3917539位点基因型频率及等位基因频率分布的比较

2.6.1 rs662 位点基因型频率及等位基因频率分布 KD 组与对照组PON1基因rs662 位点AA、AG、GG基因型频率分布和A、G 等位基因频率分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1）。KD 组中合并冠状动脉损害组与未合并冠状动脉损害组PON1基因rs662 位点AA、AG、GG 基因型频率分布和A、G 等位基因频率分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2）。

表1 KD组和对照组rs662位点基因型频率及等位基因频率分布比较 例（%）

表2 合并冠状动脉损害组和未合并冠状动脉损害组rs662位点基因型频率及等位基因频率分布比较 例（%）

2.6.2 rs3917541 位点基因型频率及等位基因频率分布 KD 组与对照组PON1基因rs3917541 位点CC、CT、TT 基因型频率分布和C、T 等位基因频率分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表3）；KD组中合并冠状动脉损害组与未合并冠状动脉损害组PON1基因rs3917541 位点CC、CT、TT 基因型频率分布和C、T 等位基因频率分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表4）。

表3 KD组和对照组rs3917541位点基因型频率及等位基因频率分布比较 例（%）

表4 合并冠状动脉损害组和未合并冠状动脉损害组rs3917541位点基因型频率及等位基因频率分布比较 例（%）

2.6.3 rs3917539 位点基因型频率及等位基因频率分布 KD 组与对照组PON1基因rs3917539 位点TT、--、-/T 基因型频率分布和-、T 等位基因频率分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表5）。KD 组中合并冠状动脉损害组和未合并冠状动脉损害组PON1基因rs3917539 位点TT、--、-/T 基因型频率分布和-、T 等位基因频率分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表6）。

表5 KD组和对照组rs3917539位点基因型频率及等位基因频率分布比较 例（%）

表6 合并冠状动脉损害组和未合并冠状动脉损害组的rs3917539位点基因型频率及等位基因频率分布比较 例（%）

3 讨论

氧化与抗氧化失衡可以导致多种疾病，如冠状动脉粥样硬化性心脏病（以下简称冠心病）、糖尿病、川崎病等。川崎病是一种儿童常见的急性发热出疹性疾病，已成为小儿后天性心脏病的主要病因，且与成年后心血管疾病关系密切[5]。KD的主要危害是心血管并发症，特别是冠状动脉，如不经及时治疗，20%～25%的患儿会发生心血管病变，主要包括冠状动脉扩张、冠状动脉瘤、冠状动脉狭窄，甚至心肌梗死等[6]。目前KD 的病因及发病机制未明，近年来研究发现KD 及其冠状动脉损害可能与氧化应激有关，KD 患儿体内长时间处于氧化应激状态，且并发冠状动脉损害患儿的活性氧类物质含量明显升高[2，7]。

PON1 是一种具有抗氧化作用的内酯酶，广泛分布于机体各组织中，当机体处于氧化应激状态时，PON1 能阻止机体的过度氧化反应，保护机体免于氧化损伤[8]。许多研究表明PON1 可以通过多种途径参与心血管疾病的调控。首先，PON1 可能通过调节巨噬细胞的胆固醇流出来发挥心血管保护作用[9]。其次，PON1 还可能在调节内皮血管扩张中起作用，PON1 可以穿透内皮细胞，通过调节Ca2+内流显著降低血管舒张[10]。再次，过度的氧化应激状态是心血管疾病重要的病理生理事件，PON1 可以通过抗氧化作用，对过度的氧化应激具有很好的调节作用[11]。

临床研究也提示，PON1 在心血管疾病的发生、发展中起着重要的作用。VAISAR 等[12]通过对1 型糖尿病患者横断面研究发现，1 型糖尿病长期无心血管并发症患者较合并心血管并发症患者PON1 水平更高，表明PON1 可能具有心血管保护作用。严为宏等[13]通过选择接受颈动脉超声检查的老年人112 例，并将其分为动脉粥样硬化组和非动脉粥样硬化组，老年人颈动脉粥样硬化患者中血清PON1 活性明显低于对照组。在实验动物模型中，还发现高糖诱导的PON1 糖基化是通过内质网应激诱导血管内皮功能障碍，抑制氧化应激可以减轻糖尿病血管并发症[14]。因此，PON1 与心血管疾病密切相关，PON1基因的改变也将影响心血管疾病的发生、发展。

PON1基因多态性与冠心病、动脉粥样硬化、心肌梗死、2 型糖尿病心血管并发症相关。MURILLO-GONZÁLEZ 等[15]通过比较分析心血管疾病组、心血管危险因素组和正常对照组的PON1基因多态性，发现PON1的CC-108 基因型与心血管疾病相关，提示PON1基因多态性与心血管疾病相关。ZHANG 等[16]对PON1Q192R 基因多态性与冠心病患者的关系进行了Meta 分析，发现PON1Q192R基因多态性与中国冠心病患者有相关性。另外，有研究报道，PON1基因多态性是冠心病的独立危险因素之一[17]。胡道军等[18]通过Meta 分析发现2 型糖尿病患者并发冠心病的风险与PON1192Gln/Arg基因多态性呈正相关，携带R 等位基因2 型糖尿病患者与携带Q 等位基因患者相比，前者更容易并发冠心病。RAHMAN 等[19]通过病例对照研究发现192R 等位基因是早期心肌梗死的独立危险因素。这些均表明PON1基因多态性与心血管疾病、某些自身免疫性疾病的心血管并发症相关，而KD 正是一种自身免疫性血管炎症疾病，心血管病变是其主要的并发症，其发病可能与氧化应激有关。故而推测，PON1基因多态性亦可能与KD 及其心血管并发症有关。

本研究采用PCR-SBT 法分析93 例KD 患儿和94例健康儿童PON1基因rs662、 rs3917541、rs3917539 位点单核苷酸多态性发现，KD 组和对照组比较、合并冠状动脉损害组和未合并冠状动脉损害组比较，基因型频率分布及等位基因频率分布差异均无统计学意义。故PON1基因rs662、rs3917541 和rs3917539 位点多态性可能与KD 的发病及其冠状动脉损害的发生无关，也可能是因为本研究样本量不够大、存在抽样误差、种族和环境因素等差异所致。因此，PON1基因多态性是否与KD 的发病及其引发的冠状动脉损害有关，还需要对其他多态性位点进行研究，或通过增加样本量进行多中心的研究。