抗疟疾药物研究进展

王婧婷，关洪鑫，张丹丹，欧阳松应

(1.福建师范大学南方生物医学研究中心，福建 福州 350117； 2.福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117)

疟疾是一种病媒传播的热带寄生虫疾病，它以雌性按蚊为主要传播媒介，在已发现的400多种按蚊中，有30种可以传播疟疾[1]．疟疾的传播强度主要取决于疟原虫、病媒媒介、人类宿主和环境等相关因素，疟疾的传播还依赖于按蚊的数量以及季节因素[2]．

目前，有5种不同的疟原虫可以引起人类感染疟疾：间日疟原虫、三日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫，其中恶性疟原虫的致死率最高，间日疟原虫是环境中分布最为广泛的疟原虫，且间日疟原虫和卵形疟原虫都会产生休眠体，导致患者在被治愈后的数月至数年中复发疟疾[2]．现阶段，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐的恶性疟原虫治疗方案为小分子青蒿素联合疗法(artemisinin-combination therapies，ACTs)[3]，但随着恶性疟原虫对青蒿素衍生物出现耐药性问题，青蒿素联合疗法的效果会被逐渐削弱．由于疟原虫的生命周期复杂，传统药物大部分只针对疟原虫的无性期血液阶段，这使得其他阶段的疟原虫仍然具有一定危险性．因此，迫切需要找到具有特异性靶点的新型小分子候选药物补充目前的抗疟疾药物库．最近一些文献报道了多种新型小分子候选药物，这些小分子可以靶向的消灭不同生命时期的疟原虫．本文将回顾过去传统临床治疗中使用的抗疟疾药物，并着重总结近几年来在新型抗疟疾药物开发方面取得的进展．

1 疟原虫的生命周期

疟原虫的生命周期按宿主的不同主要分为两个大的阶段：蚊虫宿主阶段及人类宿主阶段．在蚊虫宿主阶段时，疟原虫的雄配子细胞存在于按蚊的中肠内腔中[4]，雄、雌配子结合形成受精卵(也称合子)，而后转变为卵母细胞(也称动合子)并穿过肠壁形成一个卵囊．卵囊释放出子孢子，向着雌性按蚊的唾液腺移动．当雌性按蚊叮咬人类时，其唾液腺内的子孢子随之进入人类体内，疟原虫的发展进入人类宿主阶段[5]．

当子孢子随着按蚊叮咬进入人类体内，首先感染肝脏．子孢子到达肝脏后，进入肝脏的入口细胞—库普费尔氏细胞并不断感染或杀死其它细胞[6]．被感染的细胞进行无性繁殖产生大量的裂殖子被释放到血液后，疟原虫开始入侵红细胞，进入红细胞内的发育时期(简称红内期)．疟原虫在红内期经多次无性繁殖，依次经过环期、滋养体期和裂殖体期[7]．在每个周期，都有大约10%的疟原虫开始发育成寄生虫的有性形态[8]．疟原虫的性发育发生在裂殖体内，疟原虫形成性环，而后形成配子体．经过10-12天的发育[6]，成熟的雄、雌配子细胞在人类宿主被蚊虫叮咬后传入蚊虫体内，并在蚊虫体内经历其蚊虫阶段的生命周期(如图1所示)．了解疟原虫的生命周期，对针对其不同阶段设计靶向药物至关重要．

图1 疟原虫的生命周期及药物作用时期Fig.1 Life cycle of plasmodium and period of drug action

2 临床使用中的传统抗疟疾药物

2.1 喹啉类药物

喹啉类药物主要包括奎宁、氯喹和伯氨喹．奎宁(如表1所示)属于4-甲氧基喹啉类衍生物，它对红细胞内期的疟原虫具有清除作用，对间日疟原虫的配子细胞也有杀伤效果．奎宁通过与α-1酸性糖蛋白结合发挥功能，α-1酸性糖蛋白在疟原虫血红素聚集解毒的过程中发挥重要作用，奎宁与之结合后疟原虫不再能聚集血红素，导致虫体毒素累积过多而死亡[9]．1910年首次报道了疟原虫对奎宁的耐药性[10]，虽然疟原虫对奎宁的耐药性较低，药物会保留一些活性，但在人体内容易出现药效延迟以及药效减弱的现象，这对奎宁的继续使用提出了挑战．

氯喹(如表1所示)是在奎宁基础上改造合成的一种抗疟疾药物[11]．氯喹可以快速高效的杀死疟原虫红细胞内期的裂殖体[12]，其对于间日疟原虫的消灭效果最优．然而，恶性疟原虫对于氯喹的耐药性已经广泛的出现在世界各地[13]．氯喹耐药性产生的原因是由于氯喹抗性转运蛋白(Plasmodiumfalciparumchloroquine resistance transporter，PfCRT)的第76位赖氨酸突变为苏氨酸所导致．在被感染的细胞内，疟原虫的消化液泡中会产生大量有毒的铁原卟啉Ⅸ片段，这些有毒片段通过与其受体结合形成惰性疟原虫色素来消除有毒片段对虫体的影响[14]，但当有氯喹存在时，氯喹通过PfCRT输送进入疟原虫消化液泡与铁原卟啉Ⅸ片段结合，使解毒过程被抑制．当PfCRT突变后，氯喹不能大量进入疟原虫的消化液泡，消除了氯喹对虫体的威胁，氯喹耐药性由此而来．

伯氨喹(如表1所示)是一种8-氨基喹啉类化合物，是目前临床使用中唯一可以有效杀死间日疟原虫和卵形疟原虫休眠体的抗疟疾药物[15]．伯氨喹对恶性疟原虫的成熟配子体和肝脏期所有阶段的疟原虫均有杀伤效果，但其对无性时期的疟原虫作用有限[16]．然而，在临床使用中伯氨喹的副作用在正常受试者中会导致少量红细胞丢失，并引起葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏的患者发生严重的溶血现象[17]，这使伯氨喹的使用受到限制．

喹啉类药物的耐药性问题日益严峻，除了上述的原因外，多药耐药1基因(Plasmodiumfalciparummultidrugresistance1，pfmdr1)的表达水平也与喹啉类药物的耐药性有关[18]，pfmdr1编码的P-糖蛋白同源物1(P-glycoprotein homologue 1，Pgh1)是一种ABC外排泵，与肿瘤细胞中存在的多药耐药(multidrug resistance，MDR)蛋白同源[19]．据文献报道，Pgh1会使喹啉类药物被隔离在疟原虫的空泡室中，从而减弱药物对疟原虫的影响，在此基础上，Pgh1与突变的PfCRT结合，可能导致更加复杂的耐药模式出现[20]．

2.2 乙胺嘧啶类药物

乙胺嘧啶(如表1所示)，属于嘧啶类衍生物，它可以减少疟原虫子孢子的增殖，也可以抑制按蚊体内配子体的发育，减少疟原虫从按蚊到人类的传播[21]．乙胺嘧啶可以靶向抑制二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)的活性．DHFR是叶酸生物合成途径中的关键酶[22]．近年来，乙胺嘧啶多与磺胺多辛(一种阻碍二氢叶酸合成酶(dihydropteroate synthase，DHPS)功能的叶酸合成抑制剂[23])联合用药．然而，在引入联合治疗后不久，这两种酶都发生了关键位点的突变导致虫体耐药性问题的出现．研究表明，DHFR中S108N突变引起疟原虫对乙胺嘧啶的耐药，而DHPS中A437G和K540E的突变则导致虫体对磺胺多辛的耐药[24]．目前，在疟疾流行的国家，携带DHFR和DHPS突变的间日疟原虫广泛存在，这也使得乙胺嘧啶类药物的使用效果大受影响．

2.3 萘醌类药物

阿托伐醌(如表1所示)，是一种亲脂性萘醌[25]，它是目前临床使用中唯一针对疟原虫线粒体细胞色素b(cytochrome b，Cytb)的药物[26]．Cytb作为细胞色素bc1复合体的一部分，对维持电子传递链的功能至关重要．在疟原虫中，细胞色素bc1复合体通过修饰Q循环中泛素酮的氧化还原将氢离子转运到膜间空间，在这个过程中二氢乳酸脱氢酶(dihydroorotate dehydrogenase，DHODH)起到催化嘧啶生物合成的作用[27]．当阿托伐醌抑制Cytb后，导致电子传递链不能继续进行，DHODH无法发挥功能，疟原虫无法从宿主体内吸收嘧啶而在生长过程中自身的嘧啶被消耗殆尽，最终导致虫体死亡[28]．目前关于阿托伐醌耐药性的研究表明，Cytb中Y268S或Y268C的突变是导致耐药性出现的主要原因[29]．

2.4 青蒿素类药物

青蒿素(如表1所示)，是一类倍半萜内酯过氧化物，其分子内部存在特殊的过氧桥基团[30]．青蒿素类药物通过在体内代谢后产生的活性物质二氢青蒿素(dihydroartemisinin
Tablets，DHA)来发挥功能(如表1所示)[31]．青蒿素的激活首先需要血红素断裂其分子内部的过氧化物桥，裂解产生大量的氧自由基，这些氧自由基重新排列形成伯碳或仲碳中心的自由基，然后将疟原虫糖酵解过程、血红蛋白降解过程、抗氧化防御和蛋白质合成途径中的重要蛋白质烷基化[31]，最终导致疟原虫死亡．这是一种非常快速和有效的反应，在单个红细胞增殖周期中，青蒿素衍生物杀灭的疟原虫数量是普通抗疟疾药物的10 000倍[32]．常见的青蒿素衍生物有二氢青蒿素和青蒿琥酯(artesunate，ASA)(如表1所示)，尽管二氢青蒿素能高效杀灭疟原虫，但是它的药物单体在人体中半衰期很短[33]，在单药治疗中不能清除大部分的疟原虫，从而导致疟疾复发．青蒿琥酯在对恶性疟原虫的治疗中也出现了药物血液循环时间短的缺陷[34]．以青蒿素为基础的联合疗法(ACTs)是目前抗疟疾治疗中的金标准．在ACT疗法中青蒿素衍生物通常与甲氟喹、苯甲醚和阿莫地喹联用．即使目前ACT疗法解决了大部分单一用药带来的缺陷，但关于青蒿素类药物的耐药性报道还是屡屡出现，在通过体外筛选抗青蒿素类药物的疟原虫时，研究小组发现疟原虫Kelch13蛋白(PlasmodiumfalciparumKelch 13，PfK13) 可能与青蒿素耐药性有关[35]．PfK13在疟原虫的生活周期中必不可少[36]，携带PfK13突变的环期疟原虫能抵抗二氢青蒿素带来的药物风暴[37]．近期，PfK13突变体在青蒿素耐药性问题中的作用被证明：携带PfK13突变的疟原虫会减少血红素的摄入，从而导致青蒿素及其衍生物不能被血红素激活，进而导致青蒿素耐药性问题的出现[38]．

表1 临床使用中的传统抗疟疾药物Tab.1 Traditional antimalarial drugs in clinical use

因此目前迫切的需要新的抗疟疾药物来提供新的治疗思路，以支持目前的ACT疗法．

3 抗疟疾新药的研发

目前对于新药的开发，最理想的状态是针对新的作用靶点开发出可以杀灭现今出现的耐药性疟原虫的新药．但在以往主要倾向于两种策略：一种是通过化学修饰的手段，修饰已经在临床中使用的药物，以克服耐药性问题或改善其药理学活性；另一种是针对传统的药物靶点，来筛选新的可以与药物靶点的其他作用位点结合的新药，但目前这两种策略筛选出的药物在临床使用中容易出现耐药性问题[39]，这就需要新的策略来筛选出新的药物解决疟原虫的耐药性问题．现阶段除了以上的两种传统策略，全细胞筛选法是筛选具有新作用模式新药的首选方案．下面将从抗疟疾新药物研发的不同策略出发，总结近些年来被研发出的新型抗疟疾药物．

3.1 基于全细胞筛选方法获得的药物

药物的全细胞筛选，是在活细胞中对化合物的作用进行检测和评估，进而筛选出药物．与其他方法相比，全细胞筛选的明显优势在于：在活体生理环境中，药物的筛选效率更高、准确性更强．在过去的几年中，通过全细胞高通量筛选出来的小分子超过300万个，其中包括数千种有效的恶性疟原虫生长抑制剂[40]．下面将着重总结一些具有代表性的全细胞筛选的抗疟疾候选药物．

3.1.1 TCAMS

葛兰素史克公司针对3D7株恶性疟原虫进行了全细胞筛选，并对筛选得到的候选药物进行了大批量的分析和优先级排序[41]，称为TCAMS(Tres Cantos Antimalarial Set)．TCAMS由13 533个单独的化合物组成，它们在体外具有抑制恶性疟原虫生长的功能[42]，这组化合物大多具有不同的化学骨架，且大多数化合物的活性原理还处于未知的状态．

TCAMS中第一个被深入研究的化合物是环丙基甲酰胺[43]，它可以抑制多重耐药的恶性疟原虫生长，并在疟疾模型小鼠中也具有活性，但在后续的实验中发现甲酰胺会导致恶性疟原虫发生高频率耐药现象[44]，这使甲酰胺的研究被迫停止．吲哚类化合物是TCAMS中被着重研究的第二个对象，它的前体化合物TCMDC-139046会与5-羟色胺2型受体((5-hydroxytryptamine 2，5-HT2)是一种经典的抗抑郁症药物靶点)结合，导致该药物作用复杂化，随后通过化学修饰的手段将其改造为具有快速杀伤活性且与氯喹耐药菌株没有交叉耐药活性的新药物[45]．研究人员也在动物体内进一步证实了这类化合物的活性，但还需要继续优化其药物分子来达到更好的治疗疟疾的效果．

3.1.2 吲哚酮

NITD609，是一种螺旋体吲哚酮(如表2所示)，由诺华公司进行全细胞筛选时发现的一种化合物．NITD609对疟原虫菌株NF54和抗氯喹疟原虫菌株K1表现出明显的杀灭效力[46]．是目前临床试验阶段中最具有潜力的抗疟疾药物之一．研究表明NITD609潜在的药物靶点是疟原虫ATP酶4(PlasmodiumfalciparumATPase 4，PfATP4)[47]，PfATP4是一种定位于恶性疟原虫质膜上的液泡质子泵，用于调节疟原虫体内的钠离子稳态，当PfATP4被抑制时，疟原虫体内的低钠环境被打破，最终会导致虫体的死亡．PfATP4在疟原虫无性时期的全部红细胞周期中均有表达，这使得针对PfATP4的药物对疟原虫作用的有效期将大大增加．

3.1.3 咪唑哌嗪

咪唑哌嗪，也是一类由诺华公司通过全细胞筛选发现的抗疟疾化合物．咪唑哌嗪对恶性疟原虫和间日疟原虫的血液期虫体具有杀伤活性，并能有效的抑制疟原虫的肝脏期休眠体[48]．但咪唑哌嗪先导化合物具有强烈的心血管毒副作用[49]，在后期的药物优化中，合成出一种具有低心血管毒副作用且抗疟活性优异的咪唑哌嗪类化合物—GNFI56(如表2所示)，它在体内代谢稳定，在疟疾模型小鼠中的药物活性优于氯喹和青蒿琥酯[5]．现阶段，已经发现GNFI56的药物作用靶点，它作用于一种在疟原虫体内普遍存在的脂质激酶—磷脂酰肌醇-4-激酶(Phosphatidylinositol (4) kinase，PI(4)K)，这种激酶可以通过磷酸化脂质来调节细胞内信号的传导和运输．咪唑哌嗪通过抑制PI(4)K的ATP结合口袋，来改变PI(4)K在细胞内的分布[50]，从而扰乱疟原虫体内的信号传导和运输．目前GNFI56已经进入临床试验阶段．

3.1.4 氨基吲哚

氨基吲哚，该系列药物是哈佛医学院研究团队在布罗德研究所的小分子文库和ICCB-L化合物库中发现的一类可以抑制疟原虫生长的化合物[51]．在对氨基吲哚进行化学优化后得到了Genz669178这一化合物(如表2所示)．Genz669178对恶性疟原虫、柏氏疟原虫和间日疟原虫有抑制虫体生长的作用，且对血液期恶性疟原虫的抑制作用最强，在为期4天的抑制实验中发现，Genz669178对柏氏疟原虫的抑制有效性高达99%[52]．在超过270天的体外耐药实验中，Genz669178并没有引起疟原虫对氨基吲哚类药物的耐药性[53]，这为氨基吲哚类药物与其他抗疟疾药物配合使用成为可能．但Genz669178的副作用也相当明显，当人类服用高剂量的Genz669178时，会引起肥胖并导致网织红细胞减少[54]，这就需要尽快的明确氨基吲哚类药物的作用机制，进一步优化其结构．

3.1.5 内过氧化物

内过氧化物类药物是目前已知的所有抗疟疾药物中，治疗效果最快的药物[55]．尽管内过氧化物类药物的代表—青蒿素类衍生物的抗疟疾效果优异，但目前还是出现了的对青蒿素类衍生物的耐药性报道[55]，寻找新的内过氧化物类药物的议题也被提上日程．OZ277是第一代被合成的内过氧化物类药物(如表2所示)[56]．它是一类三恶烷，在体内可与恶性疟原虫ATP酶6(PlasmodiumfalciparumATPase 6，PfATP6)结合发挥功能，在体外对疟原虫的生长有抑制作用，但后续实验证明OZ277的稳定性较差，不能在体内发挥稳定的药效．所以在OZ277的基础上合成了OZ439(如表2所示)，它为1,2,4-三恶烷，与第一代三恶烷相比，OZ439消除疟疾的功能更为强大，并且显示出良好的稳定性及安全性，它在印度已经被批准在临床治疗疟疾中使用[57]．

表2 基于全细胞筛选方法筛选出的候选药物Tab.2 Candidates screened by whole cell screening method

3.2 基于药物作用靶点筛选出的候选药物

在过去的几十年中，对经典抗疟疾药物的研究不断加深，这些经典药物的作用靶点也被陆续阐明，促使新药的研发可以围绕这些新发现的药物作用靶点来展开，这就是基于已知药物作用靶点筛选新药的方法．目前在临床实验中的大多数候选抗疟疾药物都是依靠这种方法筛选的[58]，如新筛选出的DHODH、DHFR和Cytb抑制剂，在下一节中将着重介绍这些利用已知药物作用靶点筛选出的新型候选药物．

3.2.1 针对二氢乳酸脱氢酶的抑制剂

二氢乳酸脱氢酶(DHODH)是参与线粒体电子传递链的酶，它在疟疾治疗中是有效的药物靶点，因为它与同源的哺乳动物二氢乳酸脱氢酶不同[25]，这使得针对疟原虫DHODH筛选出的新药更具靶向性．当PfDHODH被抑制时，疟原虫线粒体内电子流动受阻导致嘧啶合成中断，最终使虫体死亡．PfDHODH是少数几个经过遗传验证的抗疟疾药物靶点[59]，是目前开发抗疟疾新药的重要靶标．现阶段利用药物的高通量筛选已经鉴定出多种PfDHODH抑制剂，包括三座嘧啶、脲类、双联叠氮以及萘酰亚胺等化合物[60]．其中针对三座嘧啶类衍生物进行优化，最终获得了DSM265(如表3所示)[61]．DSM265在人体内的疗效与氯喹类似，药代动力学实验表明DSM265具有良好的生物利用度和较长的半衰期，它是首个进入人类抗疟疾临床试验的PfDHODH抑制剂．后续在DSM265基础上利用化学修饰的手段开发出了DSM421(如表3所示)，DSM421中的CF3-吡啶基团取代了原本DSM265上的CF5-苯胺基团，这样的改变使DSM421与PfDHODH结合口袋的结合能力增强[62]，并在体外表现出优于DSM265的药理学与药代动力学活性．目前关于DSM421的开发正处于临床试验阶段．

3.2.2 针对细胞色素Bc1复合体的抑制剂

疟原虫线粒体代谢的一些功能对于虫体生长以及生存至关重要，这就使得一些线粒体相关的蛋白成为了重要的抗疟疾药物靶点[63]．细胞色素Bc1复合体(cytochrome bc1 complex，cyt bc1)就是其中最有前景的抗疟疾药物靶点之一．研究证实Cyt bc1中的喹啉氧化酶活性位点(Qo)和醌类还原酶活性位点(Qi)均可以被药物有效抑制[64]．其中，Qo位点是阿托伐醌的药物作用靶点，近期筛选出了新的与Qi位点结合的抑制剂—葛兰素史克公司开发的两个4(1H)-吡啶酮衍生物GSK932121和GW844520(如表3所示)[65]，这些研究为Qi位点作为药物作用靶点提供了结构基础，也为新药的研究提供可能．MJM170(如表3所示)是最近发现的一种新的Cyt bc1抑制剂[66]，对刚地弓形虫和恶性疟原虫的生长都有抑制作用，后续可以利用化学修饰的手段使MJM170成为抗疟疾候选药物．

3.2.3 针对磷脂酰肌醇激酶的抑制剂

磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol kinases，PIKs)是一类催化磷脂类物质磷酸化的酶类，在真核细胞中主要催化磷脂酰肌醇磷酸化．磷酸化后的磷脂酰肌醇被称为磷酸肌醇，它参与细胞膜的信号转导以及膜动力学的调控[67]．在PIKs中，Ⅲ型β亚型磷脂酰肌醇-4-激酶(phosphatidylinositol 4-kinase Ⅲβ，PI4KⅢβ)是非常重要的抗疟疾药物靶点，在疟原虫内部，PI4KⅢβ被抑制会导致磷脂酰肌醇-4-磷酸分布不均，并干扰细胞分化[50]．利用表型筛选法筛出的药物咪唑哌嗪后来被证实其作用靶点就是PI4KⅢβ[50]，后续利用PI4KⅢβ作为药物靶点筛选抑制剂的研究也在持续的进行中．

MMV 390048是一种氨基吡啶类化合物(如表3所示)，它是针对疟原虫磷脂酰肌醇-4-激酶(Phosphatidylinositol 4-kinase，PI4K)的抑制剂[68]，目前正处于临床试验阶段，这是一种具有化学预防潜力的多阶段抗疟疾药物．CHMFL-PI4K-127(如表3所示)也是一种新发现的PI4K抑制剂，它具有一个吡啶-磺胺骨架．CHMFL-PI4K-127对于3D7恶性疟原虫菌株具有强的抑制活性，而且对于恶性疟原虫来源的PI4K具有高度的选择性，在疟疾模型动物中也表现出良好的药代动力学活性[69]，这为其成为新的抗疟疾候选药物提供了良好的基础．

3.2.4 针对组蛋白去乙酰化酶的抑制剂

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDACs)的功能是去除组蛋白上的赖氨酸ε-N-乙酰基，HDACs是治疗人类多种疾病的药物靶点，包括精神疾病、神经退行性疾病以及癌症[70]．在恶性疟原虫中，发现了两个与人类HDAC I类和II类蛋白具有同源性的蛋白，分别是恶性疟原虫组蛋白去乙酰化酶1(Plasmodiumfalciparumhistone deacetylase 1，PfHDAC1)和恶性疟原虫去乙酰化酶2(Plasmodiumfalciparumsilent information regulator 2，PfSir2)(将这两种蛋白统称为PfHDACs)[71]．当PfHDACs被抑制时，会使疟原虫的整体组蛋白发生乙酰化修饰进而导致转录调控发生改变，此外PfHDACs的抑制剂还会使疟原虫的染色体发生变异，基于以上实验结论确定了PfHDACs为新的抗疟疾药物靶点[72]．在人类HDACs抑制剂的基础上，开发出了更有选择性且药效更强的化合物2-氨基辛二酸衍生物(如表3所示)，它可以引起恶性疟原虫组蛋白的高乙酰化问题，导致有2%～20%的基因转录发生改变[73]．PfHDACs作为新被证明的抗疟疾靶点，其抑制剂的筛选必然会成为抗疟疾新药研发的新方向，其抑制剂也将在抗疟疾药物中占有一席之地．

3.2.5 针对二氢叶酸还原酶的抑制剂

在众多治疗疟疾的手段中，有一种方法是同时抑制疟原虫的叶酸合成和四氢叶酸循环，这种方法可以非常有效的抑制疟原虫生长．二氢叶酸还原酶(DHFR)是叶酸合成途径中的关键酶．当DHFR在体内正常存在时，其催化产物5,10-亚甲基四氢叶酸是DNA合成中必须的甲基基团供体，将脱氧尿苷单磷酸转化为脱氧尿苷三磷酸，然后被DNA聚合酶用于将胸腺核苷酸添加进正在合成的DNA链中[74]．针对恶性疟原虫DHFR的传统抑制剂乙胺嘧啶已经出现了耐药性问题，但可喜的是恶性疟原虫和人的DHFR与抑制剂的晶体结构已经被解析，基于结构信息设计了新型小分子P218，并对其进行了药代动力学研究(如表3所示)[75]，现阶段的研究发现P218可以避免交叉耐药和DHFR突变所引起的耐药问题．它有着不同于乙胺嘧啶的抑制机制，P218在DHFR中有一个新的结合位点[76]，这个位点会覆盖住二氢叶酸底物所绘制的包膜，为乙胺嘧啶类药物产生的耐药性问题提供了解决机制．

表3 基于药物作用靶点筛选出的候选药物Tab.3 Candidate drugs screened based on drug targets

3.3 新发现的抗疟疾药物作用靶点

在抗疟疾药物的筛选过程中，一大部分的候选药物是针对已知的抗疟疾药物作用靶点所设计或筛选出的抑制剂，但目前对于抗疟疾药物的研究已经不满于此，经过试验确定了一些可能具有抗疟疾作用的新靶点蛋白，希望利用新的靶点筛选出新的候选药物．下面的章节将介绍现阶段最有希望成为新的抗疟疾靶点的蛋白质，未来可以作为药物作用靶点来筛选新的抗疟疾候选药物．

3.3.1 恶性疟原虫蛋白激酶PfCLK3

激酶是一种关键的调节蛋白，它对调控许多细胞反应至关重要．恶性疟原虫的激酶组大约由90种不同的蛋白质组成，其中就包括许多与高等真核生物激酶家族无同源性的成员，这些成员有望成为新的药物靶点[77]．总共鉴定出大约30%与疟原虫生存有关的激酶[78]．在这些激酶中，恶性疟原虫周期依赖性蛋白激酶3(P.falciparumCLK3(cyclin-dependent-like kinase)，PfCLK3)是疟原虫周期依赖性蛋白激酶家族(P.falciparumCLK(cyclin-dependent-like kinase)，PfCLKs)中的一员，疟原虫CLK家族和人类CLK家族以及富含丝氨酸精氨酸的蛋白激酶家族(serine/arginine-rich protein kinase，SRPK)关系密切[79]，它们都是剪接因子上参与多重磷酸化过程的重要蛋白．PfCLK3可以磷酸化疟原虫富含色氨酸精氨酸的SR蛋白[80]，并在寄生虫的RNA加工过程中发挥功能，这就提示PfCLK3蛋白的抑制剂可能在疟原虫的全部生命周期中发挥功能．研究人员对25 000个化合物进行筛选，最终找到了TCMDC-135051[81]，在后续的研究中发现TCMDC-135051能快速杀死滋养体期的疟原虫，并且能抑制配子细胞的发育以及肝脏期疟原虫的发育．体外实验表明TCMDC-135051能有效抑制恶性疟原虫、柏氏疟原虫、间日疟原虫以及诺氏疟原虫的CLK3激酶活性[82]．因此TCMDC-135051有望成为一个新的药物前体．此外，以PfCLK3作为药物作用靶点进行更大规模的化合物筛选也许将带来更加有效的小分子候选药物．

3.3.2 恶性疟原虫己糖转运蛋白PfHT1

葡萄糖是红内期疟原虫的主要能量来源，由于疟原虫体内缺乏能量储存机制，疟原虫几乎完全依赖糖酵解过程提供能量[83]，所以受感染的红细胞比正常红细胞要消耗更多的能量．而疟原虫在红细胞内的复制，也依赖于丙酮酸在疟原虫体内转换为乳酸而产生的ATP[84]．在宿主体内，葡萄糖通过人类葡萄糖转运体1(human glucose transporter1，hGLUT1)从血浆中进入红细胞．而在疟原虫中，只有唯一的一种己糖转运蛋白(P.falciparumhexose transporter 1，PfHT1)负责转运葡萄糖进入细胞[85]．实验证实，hGLUT1只能转运D-葡萄糖，而PfHT1则可以非选择性的同时转运D-果糖和D-葡萄糖[86]．因此，利用PfHT1和hGLUT1与底物相互作用的差异，可以设计出有针对性的PfHT1抑制剂，而这也提示PfHT1是抗疟药物新型潜在靶点．目前，发现一种新的选择性抑制剂C3361，通过对比PfHT1和D-葡萄糖复合物的结构与PfHT1和C3361复合物的结构发现，C3361明显诱导了PfHT1的重排，产生了一个新的口袋结构，这为设计特异的选择性抑制剂提供了结构基础[87]．在后续的研究中，该团队设计出了TH-PF系列化合物，与C3361相比TH-PF系列的活性及选择性更高．结构生物学研究表明当TH-PF系列同时作用于PfHT1和人源葡萄糖转运蛋白3(human glucose transporter 3，hGLUT3)时，hGLUT3的构象没有发生明显变化且没有类似于PfHT1的特异性口袋结构出现，这说明TH-PF系列具有很好的选择性．虫体实验表明，该系列化合物的抑制能力随着环境中葡萄糖浓度的降低而增强，且能有效抑制疟原虫的糖酵解活性[88]，达到“饿死”疟原虫的效果．这将是一种新的抗疟疾药物开发思路，将为后续的药物开发奠定基础．

4 展望

在过去的几十年中，传统抗疟疾药物不断出现耐药性报告，对于传统药物的使用疗效产生担忧，即使是在临床使用中最为快速有效的青蒿素及其衍生物也引起了疟原虫耐药，这无疑是消除疟疾路上的一大拦路石，但这也促使科研人员加快了对抗疟疾候选药物的研究．早期，通常通过一些表型筛选的方法来筛选鉴定抗疟疾化合物药物，随着基因组学和蛋白质组学的发展，科研人员将目光聚焦在发现新的抗疟疾药物靶点上，利用新发现的靶点有针对性的设计和研发出新的小分子药物，由此产生的新治疗方案也在临床试验中表现出良好的治疗效果．不仅如此，即使这类药物在使用过程中发生药物靶点突变导致疟原虫耐药，也可以快速且有效的设计出新的有针对性的药物来抵抗靶点突变所带来的耐药性问题．除此之外，研究人员还可以对一些在疟原虫生存中起到关键作用的蛋白质进行研究，确定新的能够在疟原虫多个生活周期中都有表达的蛋白质作为药物靶点，这样筛选并设计一些药物小分子针对不同生活周期的疟原虫，从根本上抑制疟原虫的传播和生存，实现消除疟疾的最终目标．