黎麦筓霉茎腐病菌分离和室内毒力试验研究

王伟青，董 杰，田 璐, 张金良

（1.北京农业职业学院，北京 102442；2.北京市植物保护站，北京 100029）

0 引言

藜麦（Chenopodiumquinoa）是一种藜科藜属植物。藜麦籽实富含蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质及膳食纤维，且低脂、低糖、零胆固醇，利用价值高，是未来最具潜力的作物之一[1]。黎麦起源于南美洲安第斯山脉，已有5 000多年的栽培历史，又称藜谷、南美藜、昆诺阿藜等，整个生育期会受到多种病虫害的侵染[2-4]。目前报道的藜麦病害有分生孢子叶斑病、甲孢叶斑病、尾孢叶斑病、黑斑病、叶斑病、穗枯病、褐斑病、菌核病、叶霉病、霜霉病、黑茎病、病毒病、根腐病和炭疽病，其中霜霉病和叶斑病是中国藜麦危害最严重的病害[5-7]。

藜麦在北京的种植刚刚起步，病虫害的研究工作正在进行之中。藜麦霜霉病和叶斑病主要为害叶片，植株近地面叶片先发病。本研究则从北京藜麦病样中分离出侵染茎杆和顶梢部分的筓霉茎腐病菌。此病原菌为害初期症状为水浸状小斑点，环绕茎杆逐渐扩展，导致茎杆变褐色腐烂，形成软腐状。为了更好地防治筓霉茎腐病菌，我们选择了几种目前在生产上防治黎麦筓霉茎腐病菌的高效、低毒、对环境友好的杀菌剂，采用菌丝生长速率法，测定了其对黎麦筓霉茎腐病菌的抑菌效果和室内毒力，旨在为田间防治黎麦筓霉茎腐病药剂筛选试验提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验对象和材料

分离病样采集于北京延庆区永宁镇南山健原藜麦园。藜麦品种：陇藜1号。播期：5月，土质为壤土。取病菌样品时间：7-8月。

试剂材料与设备：马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA（青岛海博生物公司）；PCR仪（美国伯乐公司）。

1.2 杀菌剂

供试杀菌剂有4种：50%多菌灵可湿性粉剂（江阴市农药二厂有限公司）、50%氟吡菌酰胺·肝菌酯悬浮剂（又称露娜森，购自德国拜耳作物科学公司和杜邦中国有限公司）、25%戊唑醇悬浮剂（青岛星牌作物科学有限公司）、70%甲基硫菌灵（青岛瀚正益农生物科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 筓霉茎腐病原菌的分离

黎麦筓霉茎腐病原菌{Exserohilumturcicum（Pass.）LeonardetSuggs}经过常规组织分离方法对病原菌进行分离培养[8]。在超净工作台中将带有病害症状的藜麦叶片在病害部位切下长宽约5 mm的叶组织，用75%的酒精浸泡20 s进行表面消毒，接着将其浸泡于0.2%次氯酸钠中，摇动使其充分接触消毒液，消毒1 min，用无菌水冲洗3遍，放置于无菌滤纸上，吸干表面水分，然后将叶组织平放在加有50 mg/mL氯霉素的PDA培养基上面，正面放置10 min后，放置于8℃恒温培养箱内进行倒置培养，培养3～5 d。

1.3.2 杀菌剂对筓霉茎腐病的室内毒力测定

50%多菌灵超微可湿性粉剂PDA平板含药剂浓度梯度为500、400、300、200、100 mg/L；70%甲基硫菌灵可湿性粉剂的浓度梯度为5 000、4 000、3 000、2 000、1 000 mg/L，50%氟吡菌酰胺·肝菌酯悬浮剂（露娜森）浓度梯度为200、150、100、50、25 mg/L；25%戊唑醇悬浮剂浓度梯度为200、150、100、50、25 mg/L。

采用菌丝生长速率法进行室内毒力试验。用无菌水将受试杀菌剂稀释10倍。加热并熔化PDA培养基，冷却至45℃左右，在18 mL PDA培养基中加入2 mL杀菌剂药液，制成含有不同浓度的药剂培养基。摇匀后，迅速将培养基倒入直径为90 mm的无菌培养皿中，以同体积无菌水的无药PDA平板为对照。培养基凝固后，从菌落边缘切下直径为7 mm的菌圆片。将菌丝体面朝下放置在含有药物的PDA平板的中心，每个平板1片，每个浓度重复3次。在25℃恒温培养箱中培养6 d后，用交叉法测定菌落直径，计算不同杀菌剂对菌丝生长的抑制率，分析比较不同杀菌剂对菌丝生长的影响[9]。

杀菌剂对筓霉茎腐病菌抑制率按下面公式计算：

根据抑制率概率转换表格将所求的抑制率换算成抑制机率值。以药剂抑制机率值为纵坐标，以各杀菌剂浓度的对数为横坐标做回归直线方程，从而得到4种杀菌剂对藜麦筓霉茎腐病菌的毒力回归方程，根据回归方程计算出EC50（有效中浓度）和相关系数R值。

2 结果与分析

2.1 组织分离法获得病原菌

取具有筓霉茎腐病原菌典型危害症状（叶片变褐色腐烂，形成软腐状）的藜麦植株病样进行组织分离病原菌。发现该病原菌在湿度大时，在茎杆上逐渐长出排列整齐、繁茂的真菌菌丝。利用组织分离法对藜麦叶片中的病原菌进行分离，得到病原菌的单菌落（图1）。

图1 组织分离法分离出的病原菌单菌落

2.2 病原菌形态特征

对分离的病原菌进行显微观察，结果如图2、图3所示，其具大型孢子囊和单孢孢子囊，接合孢子在钳状的配囊柄上形成；小孢子囊簇生在茎顶端膨大的球体上，含有一个孢囊；大孢子囊附着在弯曲下垂的茎顶端，含有许多孢囊，暗色，孢子壁具线状条纹，两端各有数根成熟的附属丝。通过显微观察发现该病原菌的菌丝特征，并根据其孢子特征可以判断为藜麦筓霉茎腐病菌。

图2 病原菌的菌丝显微图片

图3 黎麦筓霉茎腐病菌孢子和孢子囊特征

2.3 不同杀菌剂对藜麦筓霉茎腐病菌菌丝生长的抑制作用

试验结果表明：4种不同浓度的药剂对藜麦筓霉茎腐病原菌的生长有一定的抑制作用，但不同药剂或同一药剂不同浓度的抑制作用不同。同一药物浓度与抑制率呈正相关。接种6 d后观察菌丝生长情况，不同浓度的50%多菌灵可湿性粉剂、70%甲基硫菌灵、50%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂、25%戊唑醇悬浮剂对藜麦筓霉茎腐病菌丝生长的抑制率分别为30.11%～43.41%，43.10%～ 70.01%，64.79%～ 73.20%，79.74%～90.67%。这表明不同浓度下同种杀菌剂对藜麦筓霉茎腐病病菌的抑菌性差异较大，其中25%戊唑醇悬浮剂在所有药剂浓度下的抑菌率都在75%以上（表1中下划线所示），所以其抑菌效果最好。25%戊唑醇悬浮剂浓度为200 mg/L时，菌落平均生长量为5.61 mm，抑菌率为90.67%，EC50为0.53 mg/L（表2）；25%戊唑醇悬浮剂的药剂浓度为25 mg/L时，抑菌率为79.74%，这说明25%戊唑醇悬浮剂对藜麦筓霉茎腐病抑菌能力最强。其次是50%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂和5 000、4 000 mg/L的70%甲基硫菌灵，其抑菌率都达到了60%以上。抑菌效果最差的是50%多菌灵可湿性粉剂，在药剂浓度在500 mg/L时，其平均菌落生长量为34.02 mm，EC50为1 273.52 mg/L（见表1、表2）。

表1 不同供试药剂浓度对藜麦筓霉茎腐病原菌的抑制效果

表2 4种杀菌剂对藜麦筓霉茎腐病病菌的室内毒力回归方程

2.4 4种杀菌剂对藜麦筓霉茎腐病菌室内毒力试验

EC50是通过抑制病原体的强度来衡量药物的毒力。不同杀菌剂对病原菌的抑制作用不同，EC50的值越小，抑制效果就越好。4种杀菌剂对藜麦筓霉茎腐病菌的室内毒力测定结果见表2。

从表2看出，50%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂和25%戊唑醇悬浮剂对藜麦筓霉茎腐病菌EC50值较小（分别为0.59 mg/L、0.53 mg/L），这两种杀菌剂表现较敏感，对藜麦筓霉茎腐病菌的毒力最强。多菌灵和甲基硫菌灵对藜麦筓霉茎腐病菌的毒力相对较弱，其EC50分别为1 273.52 mg/L和1 887.92 mg/L。4种供试药剂的相关系数均大于0.89，较接近1，说明各回归方程中的变量线性关系密切，试验结果可信。

3 结论与讨论

随着2015年以来藜麦在北京地区示范推广，各种病害的危害程度越来越严重，对藜麦产量构成了较大的威胁。如果在生产上仅靠抗病品种无法控制病害的情况下，药剂防治就成了有效控制藜麦病害流行的关键技术措施[10]。

本试验选用低毒、低残留、污染小的4种常用杀菌剂对藜麦筓霉茎腐病病菌测定了室内抑菌效果，研究结果表明，4种杀菌剂对藜麦筓霉茎腐病病菌均有不同程度的抑制作用，其中50%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂和25%戊唑醇悬浮剂在药剂浓度25 mg/L时抑菌率分别达到64.79%和79.74%，所以50%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂和25%戊唑醇悬浮剂的抑菌效果最好，其次是较高浓度的70%甲基硫菌灵，杀菌效果最差的是多菌灵。

本试验研究中表现最好的药剂是25%戊唑醇。戊唑醇是一种广谱性大、高效、可内吸的三唑类杀菌剂，具有保护植物、治疗和根除病害的功能。由于其杀菌范围广、有效期长，与其他三唑类杀菌剂一样，能抑制真菌中麦角甾醇的生物合成，可用于控制多种真菌病害[11]。宁楠楠等测定了马铃薯干腐病菌的抑制作用，结果表明用60 g/L戊唑醇500～1 000倍具有较强的抑制作用[12]。孙清华测定了喷施113 mL/t戊唑醇能够有效抑制马铃薯干腐病[13]。白剑宇等研究发现戊唑醇对榛子苗期根腐病菌具有明显的抑菌效果[14]。

为防止或延缓对藜麦筓霉茎腐病原菌出现抗性，应避免多次单一重复使用某一种药剂，可以与其他几种抑菌效果较好的药剂进行轮换使用，实现高效、安全防治的目标。本试验仅为室内可控条件下的测定结果，仅可作为田间实际病害防治的一个参考依据，其在田间的使用效果还可能受到环境因素、病害发生时期以及农药的使用剂型等诸多因素的影响。后续可以将筛选出来的杀菌剂进行田间试验，以便筛选出适合田间进行此病害防治的杀菌剂。