高效液相色谱法测定番茄酱中乙二胺四乙酸二钠

◎ 乌吉木

（巴彦淖尔市产品质量计量检测中心，内蒙古 巴彦淖尔 015000）

乙二胺四乙酸二钠，也可称作EDTA-2Na，是一种重要的络合剂，能络合亚铁离子。它不仅能作为真空采血管中的血液抗凝剂，还可以用在食品添加剂方面，控制聚合反应快慢，通常作为螯合剂、防腐剂和抗氧化剂等来使用。EDTA-2Na不仅能阻止食品由于金属离子作用而出现的腐败、变质，还能有效地遏制维生素C被氧化，减少营养物质的损失，同时还能够阻止油脂的过氧化值升高、口感变差。

但是过量乙二胺四乙酸二钠对人体有害，其每日允许最大摄入量为0.205 mg·kg-1。美国对乙二胺四乙酸二钠有严格的限量要求，如液体状多种维生素制剂不得超过150 mg·kg-1（与铁离子一起作为液体状多种维生素制剂中维生素B12的稳定剂）、罐装黑斑豆不得超过145 mg·kg-1（护色）、罐装菜豆不得超过165 mg·kg-1（护色）。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）规定酱菜和罐头不得超过0.25 g·kg-1[1]。在不同介质中乙二胺四乙酸二钠的测定方法有比色法、滴定法、高效液相色谱法以及离子色谱法等[2-5]。比色法和滴定法无法定性只能定量，高效液相色谱法既能定性又能定量，因此本文通过高效液相色谱法对乙二胺四乙酸二钠-Fe标准物质外标法定性定量，根据方程计算出乙二胺四乙酸二钠-Fe络合物的含量，也就是乙二胺四乙酸二钠的含量[6-13]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇，色谱级；乙酸，色谱级；盐酸，分析纯；四丁基溴化铵，分析纯；乙酸钠，分析纯；三氯甲烷，分析纯；三氯化铁，分析纯；水，去离子水。

乙二胺四乙酸二钠标准品，中国计量科学研究院，编号GBW（E）060025d，批号1504，规格40 g，纯度99.95%

1.2 仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器）；电子天平，感量为0.1 mg和0.01 g；离心机，转速≥7 500 r·min-1；涡旋振荡器；超声波清洗机；微孔滤膜（0.45 μm）。

1.3 仪器条件

色谱柱：Agilent XDB-C18，柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5.0 μm；流动相比例：A-四丁基溴化铵-乙酸钠混合溶液90%，B-甲醇10%；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10～20 μL；柱温：35 ℃，检测波长：254 nm。

1.4 实验方法

1.4.1 试剂配制

（1）三氯化铁溶液。将0.54 g三氯化铁，溶于90 mL去离子水中，加入0.1 mL盐酸，100 mL容量瓶定容充分摇匀。

（2）四丁基溴化铵-乙酸钠混合溶液。称取6.45 g四丁基溴化铵、2.46 g乙酸钠加20 mL乙酸,用水定容至1 000 mL。

1.4.2 标准溶液配制

（1）标准液的制备。乙二胺四乙酸二钠标准储备液（1 000 μg·mL-1）：精确称取 0.1 g（精确至0.000 1 g）乙二胺四乙酸二钠标准品，放入100 mL容量瓶，用去离子水溶解并定容。

（2）标准工作液。分别吸取乙二胺四乙酸二钠标准储备液0.05 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL及1.00 mL，分别用水定容至100 mL、10 mL、10 mL、10 mL、10 mL 及 10 mL，配制成 0.5 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1及100.0 μg·mL-1浓度的乙二胺四乙酸二钠标准系列溶液（配制系列需加FeCl3溶液1 mL，再用水定容）。

1.4.3 样品处理

（1）样品提取。准确称取5 g（精确至0.01 g）试样于50 mL离心管中，加入15 mL水，涡旋混合提取10 min，然后加三氯甲烷20 mL溶液，涡旋混合提取10 min，4 000 r·min-1离心 10 min，将上清液转移至50 mL玻璃具塞比色管（容量瓶）中，再用15 mL水重复提取2次，合并提取液于50 mL具塞玻璃比色管中[14]。

（2）样品衍生化。向上述样品提取液中加1mL FeCl3溶液涡旋混合、超声20 min，用水定容至刻度。

（3）样品净化。准确移取10 mL上述衍生化样品溶液于50 mL具塞玻璃离心管中，加入5 mL三氯甲烷，在涡旋混合器上混合10 min，4 000 r·min-1离心5 min。上清液用0.45 μm滤膜过滤，滤液供液相色谱测定。

2 结果与分析

2.1 线性关系

如图1所示，在上述方法条件下，标准系列在0.5～100.0 μg·mL-1呈线性关系，通过计算峰面积（y）与浓度（x，μg·mL-1）得线性方程公式为y=14.698 36x+0.395 69，相关系数r=0.999 992，实验结果表明线性范围良好。

图1 标液线性关系图

2.2 空白及乙二胺四乙酸标准品色谱图

实验结果如图2、图3所示，在上述试验仪器条件下，试剂空白图无杂峰出现，标液出峰良好，理论塔板高。

图2 乙二胺四乙酸二钠空白色谱图

图3 乙二胺四乙酸二钠标液出峰色谱图

2.3 精密度及回收率

空白番茄酱样品中加入浓度为1 000 μg·mL-1的乙二胺四乙酸二钠标准储备液0.15 mL和1.00 mL，进行2个水平的加标回收试验，测定含量分别为0.03 g·kg-1和0.20 g·kg-1。每个浓度试样水平平行测定8次，计算回收率和相对标准偏差（RSD），见表1。当加标浓度为 0.03 g·kg-1时，8 次测量平均值为 0.024 90 g·kg-1，回收率平均值为82.93%；当加标浓度为0.20 g·kg-1时，8次测量平均值为0.183 0 g·kg-1，回收率平均值为91.48%。

表1 番茄酱加标回收数据统计表

2.4 检出限的测定

以仪器的S/N=3计算，测得该方法乙二胺四乙酸二钠的最低检出限，结果如表2所示。用外延法计算该实验室本检验方法检出限。用番茄酱加标0.01 g·kg-1进行检出限测定，乙二胺四乙酸二钠方法检出限是0.002 g·kg-1。

表2 最低检出限测定数据统计表

2.5 样品处理方法的选择

根据《食品安全国家标准 食品中乙二胺四乙酸盐的测定》（GB 5009.278—2016）的前处理方法，样品加入水提取之后络合，经混合阴离子固相萃取柱净化时样品中的杂质与乙二胺四乙酸二钠竞争吸附柱易导致回收不理想。因为乙二胺四乙酸二钠络合物易溶于水，所以用水来提取效果好，成本也低。由于番茄酱基质复杂，影响实验结果，不容易分离，还有可能堵塞仪器，故提取液中加入一定量的三氯甲烷，乙二胺四乙酸二钠不易溶于有机溶剂，三氯甲烷可以与水分层，溶解样品中的杂质，起到非常好的净化效果，且提取液中加入还原剂使乙二胺四乙酸二钠与三氯化铁形成络合物，经过再次净化去除杂质测定时能够达到很好的回收率和分离效果，见图4、图5。

图4 番茄酱中无乙二胺四乙酸二钠出峰色谱图

图5 番茄酱中加乙二胺四乙酸二钠出峰色谱图

2.6 仪器条件的选择

根据《食品安全国家标准 食品中乙二胺四乙酸盐的测定》（GB 5009.278—2016）规定的色谱条件，乙二胺四乙酸二钠-Fe需要在较低的pH环境下测定，本实验探索了3种流动相条件，分别加入磷酸调节四丁基溴化铵-乙酸钠混合溶液的pH=4.0、pH=2.5，加入20 mL乙酸调节四丁基溴化铵-乙酸钠混合溶液进行试验，试验表明加入20 mL乙酸没有测定pH的混合溶液对乙二胺四乙酸二钠-Fe分离效果最好，见图2、图3。

2.7 色谱条件选择

WatersSunFire-C18、Tnature-C18、Phenomenex-C18和Agilent XDB-C18作为液相色谱柱和A-四丁基溴化铵-乙酸钠混合溶液、B-甲醇（A∶B=90∶10）作为流动相进行试验。结果表明，Agilent XDB-C18对乙二胺四乙酸二钠-Fe和干扰物能够达到很好的分离效果，通过调整流速和流动相比例对EDTA的出峰时间进行调整。

本试验中标液用A-四丁基溴化铵-乙酸钠混合溶液，B-甲醇（A∶B=85∶15）作为流动相，流速0.8 mL·min-1出峰良好，试验中采用以上条件对未添加乙二胺四乙酸二钠的番茄原酱进行检测，谱图中杂质峰与标液EDTA峰重合，容易造成误判。A-四丁基溴化铵-乙酸钠混合溶液，B-甲醇（A∶B=90∶10）作为流动相，流速1.0 mL·min-1可以达到很好的分离效果。

3 结论

本实验优化了高效液相色谱法测定番茄酱中添加剂乙二胺四乙酸二钠的前处理方法和高效液相色谱检测方法，通过对样品前处理条件的调整，使样品只要进行溶液涡旋液液萃取加以衍生，即可对乙二胺四乙酸二钠的含量进行测定，流动相采用乙酸不需要调节pH值，且不易造成色谱柱堵塞。本方法简单、快速、重复性和回收率较好，具有较高的准确度和精密度，能实现检测番茄酱中乙二胺四乙酸二钠的需要，可为食品中检测乙二胺四乙酸二钠提供实际操作和技术参考。