气相色谱串联质谱法测定蔬菜水果中三氯生及甲基三氯生

张春雨

三氯生是一种家庭厨卫和个人护理产品中使用较多的抗菌剂，从2016年开始，欧盟及美国等国家均已禁止将其应用于洗护产品[1]。含有三氯生的药物及洗护用品，随着人们使用过程中生活污水的排出而排放到水生环境中，并稳定存在于污水、污泥和地表水中，是一种新兴的污染物[2]。甲基三氯生的脂溶性和毒性作用较强，如果在农田或果园中施入含有三氯生和甲基三氯生的沉积物肥料或污水，可增加蔬菜和水果中的三氯生和甲基三氯生污染风险，从而影响食用者的身体健康[3]。气相色谱-串联质谱法是临床检测三氯生和甲基三氯生的常用方法，本研究于2020年9月1日—10月31日，采用上述方法对蔬菜水果中的三氯生和甲基三氯生含量进行了检测，以便了解蔬菜水果的污染情况，从而更好地评估农产品质量安全风险。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

本研究实验于2020年9月1日—10月31日开展，所使用仪器包括气相色谱-串联质谱仪、氮吹仪、超声波清洗机、旋转蒸发仪、高速冷冻离心机、理化干燥箱、电子天平、多管旋涡混合仪。

1.2 标准溶液制备

（1）三氯生标准溶液制备：称取5.0 mg的TCS标准品，使用甲醇将其溶解至100 mg/L，转移至50 mL的容量瓶中后，使用甲醇对其进行定容后，混合均匀并密封，保存于4℃条件下。

（2）甲基三氯生标准溶液制备：称取5.0 mg的MTCS标准品，使用甲醇将其溶解至100 mg/L，转移至容量瓶中后使用甲醇定容，混合均匀后保存于4℃条件下作为储备液。

（3）混合标准溶液：选取适量三氯生和甲基三氯生标准储备溶液，使用甲醇将其稀释到0.4 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L和20.0 μg/L的混合溶液，保存在4℃条件下。

（4）制备浓度为99.5%的三氯生标准品和98.9%的甲基三氯生标准品；制备体积比为99：1的三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷混合溶液作为衍生试剂，选用的甲醇和乙酸乙酯均为色谱纯。

1.3 仪器工作条件

色谱条件：使用DB-17MS毛细管色谱柱，进样品温度为280℃，进样体积1 μL，毛细管色谱柱参数为30 m×0.25 mm，0.25 μm，以纯度为99.99%的氦气为载气，不分流进样，流量设置为14 mL/min。进行毛细管色谱柱升温程序设计，初始温度150℃，维持1 min后，按照25℃/min的速度对其进行升温，待其温度上升至250℃后按照5℃/min的速度使其上升至260℃。达该温度后以30℃/min的速度继续升温至290℃，并维持1 min。操作过程中总的运行时间为9 min。

质谱条件：采用电子轰击离子源，设置电离能量为70 eV，离子源温度250℃，应用多反应监测模式，溶剂延迟3 s，将传输线温度控制在250℃。

1.4 试验方法

本研究水果选取苹果、橙子，蔬菜选取黄瓜和西红柿作为样品，橙子去皮后切成小块，苹果、黄瓜及西红柿均切块，匀浆后保存于-22℃条件下备用。每种样品均称取5.0 g，将其置入离心管中，加入乙酸乙酯10 mL后，以2 500 r/min的速率对其进行2 min的转速匀浆，超声提取10 min后，以10 000 r/min的速度进行离心处理，10 min后取出上层有机相至鸡心瓶，并对下层残渣进行二次提取，将获得的2次提取液同样装入鸡心瓶中。对该瓶中的提取液进行旋转蒸发，待其近干后，使用乙酸乙酯对鸡心瓶进行洗涤，重复2次后取洗涤液至玻璃离心管中，对其吹氮至近干，并加入体积比为99：1的三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷混合溶液，于60℃环境下，使其进行硅烷化衍生化反应，衍生结束后吹氮至近干，并使用乙酸乙酯对残渣进行溶解，获得待测液后按照相关工作条件对其实施测定。

1.5 观察指标

观察样品在色谱-质谱条件下，扫描后的质谱图，计算并记录三氯生、甲基三氯生的先性方程、检出限等情况，并分析该方法检测的精密度和回收率。

2 结果

2.1 样品前处理

在实际测定过程中，由于三氯生在进样口的灵敏性较低，而在色谱柱中往往具有较高反应性，很容易造成其色谱峰出现拖尾的情况，进而对测定结果的准确性造成影响。甲基三氯生作为三氯生的甲基化产物，在进行衍生化反应时应避免应用甲基化试剂，所以本研究采用了硅烷化衍生试剂对三氯生进行改性，其具体衍生化反应过程如下图1所示。

图1 三氯生的衍生化反应

本次试验中在将衍生物反应残留物用氮气吹干后，选用子酸乙酯对其茶渣进行溶解，能够有效减少前处理过程中，因试剂转换所导致的干扰效应，能够增强检测方法的兼容性。通常情况下，在对样品进行提取和浓缩等处理后，需要对其进行净化处理，如畜产品和水产品，由于所含有的脂肪和蛋白质成分较多，通常需要对其先进行净化处理，然后再对其进行分析。而本次试验测定的蔬菜和水果，因其基质成分相对较为简单，所以样品在经提取和浓缩等处理后，可不再进行净化处理。

2.2 定性鉴别两种物质

2.2.1 全扫描模式 通过对三氯生衍生物和甲基三氯生实施一级质谱全扫描，将质荷比（m/z）设置在50～500，于70 e电离能量轰击下，获得相应的一级质谱图，并确定其分子离子与碎片离子的m/z，其一级质谱图如图2所示。通过分析可以发现，三氯生衍生物经一级质谱扫描后，分子离子的m/z为360.99，离子丰度最高的m/z为346.95，如图2（a）。甲基三氯生的以及质谱图显示分子离子m/z为304，丰度最高的离子为303.97，如图2（b）所示，主要为甲基三氯生丧失一个甲基和一个氯之后所得。

图2 三氯生衍生物与甲基三氯生的全扫描一级质谱图

通过将三氯生衍生物m/z 360.99、甲基三氯生m/z 303.97分别对应的分子离子作为母离子，对其实施二级质谱全扫描，可进一步获得与之对应的特征子离子，以保障对目标物鉴定的专属性，其二级质谱图如图3所示，其丰度最高的子离子分别对应为m/z 347.25和m/z 254.23。

图3 三氯生衍生物碎片m/z 362与甲基三氯生特征碎片的二级质谱图

2.2.2 多反应监测模式 通过在多反应监测模式下，扫描得出三氯生衍生物、甲基三氯生的母离子后，使用10 V的碰撞解离电压，对其进行碰撞解离，然后经扫描得出相对应的子离子，从而得到目标物的特征离子对。确定扫描程序：对三氯生衍生物扫描时间0～6.1 s，母离子m/z 362，子离子m/z 347。甲基三氯生扫描时间6.11～9.00 s，母离子m/z 360，子离子m/z 254，利用MRM扫描程序对三氯生衍生物、甲基三氯生的混合溶液进行扫描，获得的总离子流色谱图（见图4）。

图4 混合标准溶液总离子流色谱图

2.3 线性参数及检出限情况

应用MRM模式对前面配置的不同浓度（0.4～20.0 μg/L）混合标准溶液进行测定，并绘制标准曲线，结果显示这两种物质的质量浓度在0.4～20.0 μg/L，与相应的峰面积之间具有线性相关关系，具体如表1所示。

表1 两种物质的线性参数及检出限

2.4 精密度与回收试验结果

通过在本研究所选取的四种样本中，加入浓度为0.02 μg/kg、0.10 μg/kg和1.00 μg/kg的混合标准溶液，均平行测定6次后，计算其相对标准偏差和回收率，得出的结果如表2所示。

表2 精密度与回收试验结果

2.5 样品分析

随机从市场上选购若干蔬菜水果，蔬菜选择土豆、西红柿、黄瓜，水果选择苹果、橘子和猕猴桃，采用上述试验方法对这些样品中的三氯生和甲基三氯生含量进行测定，结果显示，在西红柿样品中检测出了这两种物质，其质量分数分别为0.208 ng/g和0.087 ng/g，其检出率均为2.8%。

3 讨论

三氯生以往是家庭厨卫与个人护理产品中使用较多的抗菌剂，但随着欧盟等西方国家严禁将其作为抗菌剂应用于洗护产品后，三氯生在我国的使用也受到了越来越多的关注。含有三氯生的相关产品，能够通过污水排放至水生环境，进而对水环境造成污染，属于新兴污染物之一。三氯生通过光化学反应和氯化反应后，可生成二噁英、三氯甲烷等毒性成分，给生态环境造成影响[4]。有研究报道，三氯生作为一种具有抗菌活性的醚类，在进入生物机体后，能够对其内分泌造成不同程度的干扰，破坏哺乳动物、鱼类和两栖动物在内多物种的内分泌功能，影响这些物种的生长发育和繁衍等功能，从而导致其发育畸形，具有较强的氧化应激和神经毒性作用[5-7]。甲基三氯生是三氯生经微生物甲基化后生成的降解产物，具有较三氯生更强的持久性、亲脂性和毒性作用，可更广泛地分布[8-9]。在日常农田和果园管理过程中，如果将含有三氯生和甲基三氯生沉积物的肥料或污水施入到在农田或果园，可增加蔬菜和水果的三氯生、甲基三氯生污染风险，对食用者的身体健康造成极大威胁[10]。因此，采取有效方法对蔬菜水果中的这些毒性成分进行检测极为重要，可直接关系到食品质量安全。

气相色谱-串联质谱法、液相色谱-串联质谱法是当前检测三氯生和甲基三氯生的主要手段[11]，气相色谱-串联质谱法通过对三氯生进行衍生化反应，能够将其转化为弱极性衍生物，更方便对其进行检验，是一种较为可靠的理化检验方法，可应用于蔬菜水果污染情况测定，在农产品质量安全监测中具有重要作用[12]。有研究报道，采用气相色谱-串联质谱法对蔬菜水果中的乙烯利、残留农药等进行检测，均具有较好的检测效果，能够为蔬菜水果等食品安全检测提供重要帮助，能够更好地保障消费者权益[13-14]。由于目前关于蔬菜、水果中三氯生、甲基三氯生含量测定的相关研究报道较少，故本研究中采用气相色谱-串联质谱法对蔬菜水果中的这些物质含量进行检测。本次实验通过对随机获取的蔬菜、水果样品中目标物含量应用上述方法进行检测，结果显示浓度在0.4～20.0 μg/L，两种目标物均具有良好线性关系，且相关系数均达到0.99以上，检出限在4～5 ng/kg，且在不同加标水平下，各种蔬菜水果的回收率在92.8%～108.0%，精密度在3.5%～12.8%，能够满足相关检测要求。

总之，气相色谱-串联质谱法具有操作简便，精密度高，检出限低等优势，将其应用于蔬菜水果的三氯生、甲基三氯生含量测定，稳定性和灵敏性良好，能够更好地了解蔬菜水果的污染情况，为农产品质量安全监测提供重要依据。