miR-189 对骨形成的影响及作用机制

刘星宇 王 杰 石 菲

1.解放军总医院京中医疗区综合内科，北京 100011；2.陕西省西安大兴医院内分泌代谢科，陕西西安 710000；3.空军军医大学航空航天医学院，陕西西安 710032

我国是世界上老年人口绝对数量最多的国家，骨质疏松症已经成为我国社会的沉重负担。因此研究其发病机制及新型药物具有重要意义[1-3]。近年来，微RNA（microRNA，miRNA）成为研究热点，其通过转录后调控等多种机制参与到骨质疏松等多种疾病的发生发展中[4-6]。研究表明miR-189 在系统性红斑狼疮、电离辐射后内皮细胞损伤和肺癌发生中发挥重要作用[7-9]，而miR-189 对骨质疏松的调控作用不明确。本研究旨在探究miR-189 对骨形成的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

澳洲胎牛血清（10100147）、DMEM 细胞培养基（31330095）和Lipofectamine 2000（11668030）购自美国Gibco 公司；RNA 抽提盒（639505）、反转录盒（639549）和扩增盒（639503）购自日本TaKaRa 公司；miR-189序列和引物购自生工生物公司；钙黄绿素（德国Merck 公司，C0875）；RUNX2 抗体（ab32147）、OSX 抗体（ab128873）和抗GAPDH 抗体（ab135745）购自美国abcam 公司。

1.2 研究方法

1.2.1 模型建立 利用随机数字表法将32 只雌性C57BL/6J 小鼠（动物合格证号SYDWZX 京20200211）分为4组：假手术组、去势组、对照组和抑制剂组，每组8只。动物饲养在标准动物房，房内温度18～22℃，湿度50%～60%。在小鼠6 个月龄时，切除卵巢（去势组）或假手术（假手术组）。将miR-189 阴性对照序列（对照组）和抑制剂（抑制剂组）注入去势小鼠体内。本研究经解放军总医院动物伦理委员会审核通过（编号20191001006）[10]。

1.2.2 micro CT 扫描参数设置为80 kV 和500 mA。分辨率为10 μm，曝光时间800 ms。取边长3 mm 的立方体作为感兴趣区域检测。三维重建，计算参数：骨密度（bone mineral density，BMD）、骨体积与总体积比（bone volume-to-total volume ratio，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁连接密度（connectivity density，Conn.D）和骨小梁分离指数（trabecular separation，Tb.Sp）[11]。

1.2.3 RT-qPCR 检测miRNA 表达量 利用RNAiso 进行骨组织裂解。反转录反应系统：2.0 μl 5×PrimeScript®Buffer、0.5 μl PrimeScript®RT Enzyme Mix Ⅰ、0.5 μl Bulge-loop RT Primer 和RNA，加水补齐10 μl。反转录：37℃预热15 min；42℃加热15 min；85℃加热5 s，得到cDNA。扩增反应系统：10 μl SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ、1.6 μl 引物、0.4 μl ROX Reference DyeⅡ和2 μl cDNA，加水补齐20 μl。扩增：95℃预变性30 s；95℃维持5 s，60℃维持34 s，40 个循环[12]。miR-189 引物序列：正向5’-ACACTCCAGCTGGGTTGCAGCTGCCTGGGAGTGA-3’，反向5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；U6 引物序列：正向5’-CTTCGGCAGCACATATAC-3’，反向5’-GAACGCTTCACGAATTTGC-3’。

1.2.4 尾静脉注射 按照1.5 mg/kg 浓度分别将miR-189 阴性对照序列：5’-GUCAUGAAAACACAUCAUGUUU-3’和miR-189 抑制剂：5’-UCGUCGUAACAUGUCCCGAUACU-3’从尾静脉注入去势小鼠体内[11]。

1.2.5 钙黄绿素染色 小鼠在处死前10 d 和3 d 腹腔注射5 mg/kg 钙黄绿素。取出股骨，固定，脱水，包埋，切片（避光）。利用荧光显微镜计算矿物质沉积率（mineral apposition rate，MAR）和成骨率（bone formation rate，BFR）等参数[13]。

1.2.6 细胞培养及转染 小鼠成骨细胞系ME3T3-E1购自上海细胞库。分组：转染miR-189 阴性对照序列的对照组、转染抑制剂的抑制剂组和转染模拟序列（5’-AGCAGCCUUGUACAGGGCUAUGA-3’）的模拟物组[11]。转染时miRNA 序列浓度为80 nmol/L。

1.2.7 Western blot 技术 利用蛋白酶裂解液制备MC3T3-E1 细胞的蛋白样本。电泳：95 V 维持30 min；转膜：250 mA 维持2 h；室温孵育一抗4 h 后冲洗，室温孵育二抗1 h 后发光[13]。

1.3 统计学方法

利用SPSS 19.0 软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验，三样本组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨质疏松模型构建

与假手术组比较，去势组出现骨微结构退化，去势组骨小梁骨量显著降低（BMD 和BV/TV 均下降），骨小梁结构明显受损（Tb.Th、Tb.N 和Conn.D 降低，而Tb.Sp 升高）（P ＜0.05）。见图1。

图1 micro CT 检测骨量变化（n=8）

2.2 去势小鼠股骨miR-189 表达情况

与假手术组比较，去势组股骨中miR-189 高表达（P ＜0.05）。见图2。

图2 RT-qPCR 检测小鼠股骨中miR-189 的含量（n=8）

2.3 miR-189 抑制剂对股骨中miR-189 含量的影响

与对照组比较，抑制剂组股骨中miR-189 低表达（P ＜0.05）。见图3。

图3 RT-qPCR 检测各组小鼠股骨组织中miR-189 的含量（n=8）

2.4 miR-189 抑制剂对去势小鼠骨丢失的影响

与对照组比较，抑制剂组骨微结构退化得到部分恢复，抑制剂组小鼠骨小梁骨量增加，骨小梁结构改善（P ＜0.05）。见图4。

图4 microCT 检测骨量变化（n=8）

2.5 miR-189 抑制剂对去势小鼠骨形成的影响

与对照组比较，抑制剂组MAR 和BFR 增加（P ＜0.05）。见图5。

图5 钙黄绿素染色检测骨形成（n=8）

2.6 寡核苷酸效率检测

与对照组比较，模拟组miR-189 增加（P ＜0.05），而抑制剂组降低（P ＜0.05）。见图6。

图6 q-PCR 检测细胞中miR-189 含量（n=4）

2.7 miR-189 抑制剂对成骨指标的影响

与对照组比较，模拟物组RUNX2 和OSX 含量降低（P ＜0.05），抑制剂组RUNX2 和OSX 含量增加（P ＜0.05）。见图7。

图7 Western blot 检测细胞中成骨指标（n=4）

3 讨论

本研究利用卵巢去除构建小鼠骨质疏松模型，micro CT 检测建模情况，发现与假手术组比较，去势小鼠骨量减低、骨微结构退化，这和目前研究报道一致[14-16]，随后又发现去势组股骨中miR-189 高表达，这暗示miR-189 可能在骨形成中发挥调控作用。为验证猜想，本研究将miR-189 抑制剂注射入小鼠体内，RT-qPCR 检测抑制剂效果，证实在体注射抑制剂后，小鼠股骨miR-189 降低，提示在体内应用miR-189 有效。

利用micro CT 检测miR-189 抑制剂对去势小鼠骨形成的影响，发现抑制剂能够对抗去势造成的骨丢失，而成骨细胞发挥了成骨作用的功能细胞[17-18]，为了探究miR-189 的靶点，利用钙黄绿素染色动态观测发现miR-189 抑制剂能够促进骨形成。

RUNX2 是RUNT 基因家族的转录因子。RUNX2是成骨细胞分化过程中最重要的特异性转录因子，在成骨细胞分化的起始诱导和后续功能基因的序贯表达中具有重要调控作用[19-22]。而OSX 是一类含有锌指结构的转录因子。在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过程中，OSX 是不可缺少的成骨细胞特异性转录因子[23-25]。为验证miR-189 对成骨细胞的作用，发现miR-189 过表达降低RUNX2 和OSX 含量，而敲低miR-189 增加RUNX2 和OSX 含量。结果显示，miR-189 抑制成骨细胞的成骨功能。

综上所述，骨质疏松小鼠股骨高表达miR-189，而miR-189 可通过抑制成骨细胞功能抑制骨形成。