猪伪狂犬病活疫苗（SA215株）保存条件的研究

阴文奇，张传明，何平元，王子建，周远成，李盛辟

（1.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066；2.畜科生物工程有限公司，四川 成都 610299；3.畜禽生物制品四川省重点实验室，四川 成都 610299）

猪伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病毒（PRV）所引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性传染病。猪是该病的天然宿主和主要储存宿主，各个年龄段的猪群均可感染［1-3］。该病在世界上分布广泛，并有不断蔓延扩大的趋势。疫苗免疫是防控猪伪狂犬病最经济、有效的方法。目前市场上流通的伪狂犬病疫苗有灭活疫苗和活疫苗。随着PRV 的基因变异，以Batha-K61 株为首的疫苗毒株对我国猪伪狂犬病的预防能力降低。郭万柱等［4］根据我国猪伪狂犬病疫情的流行情况，以野毒Fa 株为亲本毒株构建了三基因（TK、gE、gI）缺失疫苗SA215 株，该疫苗株具有良好的稳定性和安全性［5-6］。该活疫苗的有效期为2～8 ℃保存12 个月。为研究保存期延长对疫苗的影响，本试验将保存期延长至21 个月后按照质量标准进行检测，为临床使用和后续产品开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料 6 批猪伪狂犬病活疫苗样 品（批 号：试201906021、试201906022、试201906023、试 201906024、试 201906025、试201906026）由畜科生物工程有限公司生产，每批取样150 瓶置-15 ℃保存，取150 瓶置2～8 ℃保存。Vero细胞，由畜禽生物制品四川省重点实验室鉴定、保管和供应。DMEM 购自Gibco 公司。新生牛血清购自内蒙古金源康生物工程有限公司。21～28 日龄断奶健康易感仔猪购自成都周边散养户。

1.2 不同保存期疫苗病毒含量的测定 在保存试验前以及-15 ℃和2～8 ℃保存6、12、18、21 个月时分别取保存样品用维持液将疫苗成品稀释至1 头份/mL，再作10 倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-75个稀释度，每个稀释度分别接种6孔板内培养形成的致密Vero 细胞单层1 孔，每孔0.1 mL，37 ℃吸附1 h。再于每孔加入DMEM 液（含甲基纤维素0.5%）2～3 mL，置二氧化碳培养箱37 ℃培养3～4 日，吸去上清液，用1%结晶紫、福尔马林染液染色20 min，弃染色液，计算蚀斑数，应≥105.0PFU/头份。

1.3 常规检测指标的测定 分别取-15 ℃和2～8 ℃保存12、18、21 个月的疫苗，按照《中国兽药典》（2015年版）附录19进行无菌检验、附录22进行支原体检验、附录16 第2 法进行外源病毒检验、附录11 进行剩余水分测定、附录7 进行真空度检验。

1.4 鉴别检验 将疫苗稀释成104.0PFU/mL，与PRV特异性血清（中和指数为700～1 000）等量混合，37 ℃中和1 h，同时设病毒对照，分别接种Vero细胞单层。置二氧化碳培养箱37 ℃培养3～5日，观察细胞病变（CPE）。病毒对照组应出现细胞圆缩、融合形成空斑等细胞病变，中和组不能出现CPE。

1.5 安全性检验 分别取-15 ℃和2～8 ℃保存12、18、21个月的疫苗，给2头20～22日龄健康易感仔猪（PRV 中和抗体效价≤1∶4）各肌肉注射2头份，观察7日并记录。

1.6 效力检验 分别取-15 ℃和2～8 ℃保存12、18、21 个月的疫苗，给4 头20～22 日龄健康易感仔猪（PRV 中和抗体效价≤1∶4）各肌肉注射1 头份。28 日后，连同条件相同的4 头对照猪，分别采血，分离血清，测定血清中和抗体滴度。

2 结果

2.1 6 批猪伪狂犬病活疫苗（SA215 株）不同保存期的病毒含量检测结果 将6 批成品苗在-15 ℃下保存6、12、18、21 个月后分别检测各批样品的病毒含量，结果显示：18 个月时病毒含量下降幅度在0.5～0.7 个滴度之间，21 个月时下降幅度在0.6～0.8 个滴度之间，但所有批次的病毒含量均远高于105.0PFU/头份的国家标准。详见表1。

表1 6批成品苗在-15 ℃条件下放置不同时间后的病毒含量检测

将6 批成品苗在2～8 ℃下保存6、12、18、21个月后分别检测各批样品的病毒含量，结果显示：18 个月时病毒含量下降幅度在0.5～0.8 个滴度之间，21 个月时下降幅度在0.6～0.9 个滴度之间，但所有批次的病毒含量均远高于105.0PFU/头份的国家标准。详见表2。

2.2 6 批成品苗在-15 ℃及2～8 ℃保存12 个月时的检测结果 将6 批成品苗分别置-15 ℃和2～8 ℃保存12 个月，然后进行性状观测、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、鉴别检验以及安全、效力、真空度和剩余水分的测定。结果显示所有指标均符合质量标准要求。详见表3和表4。

表3 6批成品苗于-15 ℃保存12个月时的检测结果

表4 6批成品苗于2～8 ℃保存12个月时的检测结果

2.3 6 批成品苗于-15 ℃及2～8 ℃保存18 个月时的检测结果 将6 批成品苗分别置-15 ℃和2～8 ℃保存18 个月，然后进行性状观测、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、鉴别检验以及安全、效力、真空度和剩余水分的测定。结果显示：病毒含量均在105.7PFU/头份以上，免疫抗体均在1∶30 以上，所有指标均符合质量标准。详见表5和表6。

表5 6批成品苗于-15 ℃保存18个月时的检测结果

表6 6批成品苗于2～8 ℃保存18个月时的检测结果

2.4 6 批成品苗于-15 ℃及2～8 ℃保存21 个月时的检测结果 将6 批成品苗分别置-15 ℃和2～8 ℃保存21 个月，然后进行性状观测、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、鉴别检验以及安全、效力、真空度和剩余水分的测定。结果显示：病毒含量均在105.6PFU/头份以上，免疫抗体均在1∶30 以上，所有指标均符合质量标准。详见表7和表8。

表7 6批成品苗于-15 ℃保存21个月时的检测结果

表8 6批成品苗于2～8 ℃保存21个月时的检测结果

3 结论

临床上使用的动物活疫苗均以冻干形式生产、保存，近年来随着真空冷冻干燥技术的发展出现了耐热保护剂活疫苗。常规疫苗通常在-15 ℃保存，而耐热保护剂活疫苗则在2～8 ℃保存。本试验使用的疫苗在取得新兽药证书时确定的质量标准为2～8 ℃保存12 个月，为研究该疫苗在不同温度条件下保存的稳定性和有效期，本试验以12 个月有效期为基础，分别选择三个批次的疫苗在-15 ℃和2～8 ℃保存，将保存期延长至21个月，并在保存后不同时间段取样进行疫苗质量测定。试验得出：6 批猪伪狂犬病活疫苗（SA215株）试制产品在-15 ℃和2～8 ℃下保存21 个月，病毒含量只有轻微下降（0.6～0.8 和0.6～0.9），每头份病毒含量均在105.6PFU以上，远高于国家质量标准（105.0PFU/头份）；免疫抗体水平均高于1∶30；性状、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、鉴别检验、安全性、效力、剩余水分、真空度等指标均符合质量标准，表明该疫苗在-15 ℃及2～8 ℃两种温度条件下保存21 个月仍然合格。本试验结果为疫苗的临床推广以及后续新产品的开发提供了新的依据。■