p16/Ki-67双染对高危型人乳头瘤病毒阳性妇女的分流作用

杨宝华， 徐 灵， 朱修香， 夏子茵， 谢晓丽， 曹云桂

1. 上海市闵行区中心医院妇产科，上海 201199 2. 上海市闵行区中心医院病理科，上海 201199 3. 上海市嘉定区妇幼保健院，上海 201800

子宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，且近年有年轻化趋势。2020年GLOBOCAN报告[1]显示：在中低人类发展指数国家中，宫颈癌的发病率和死亡率均高居女性恶性肿瘤的第2位。人乳头状瘤病毒感染常见，多为一过性感染，易被人体自身免疫系统清除，其中高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papilloma virus, HR-HPV)持续感染是宫颈癌的重要病因[2-3]。因此，2019年美国阴道镜和宫颈病理协会(ASCCP)《基于风险的宫颈癌筛查结果异常的管理共识》[4]建议将单独HR-HPV或HR-HPV与细胞学检查联合用于作为宫颈癌初筛，对单独HR-HPV初筛呈阳性的妇女采用细胞学检查进行分流。但细胞学主观性强，且我国细胞学医师较少。

2020年11月WHO发布《加速消除宫颈癌全球战略》，要求2030年70% 的35～45岁女性接受宫颈癌精准筛查。为了达到这一目标，须寻找新的生物学标志物，从而对HR-HPV呈阳性妇女进行有效分流，这是我国亟待解决的问题。已有研究[5-7]发现，HR-HPV的E7癌基因整合至宫颈上皮细胞，破坏了细胞的正常周期，引起包括Ki-67、p16蛋白在内的原本正常的细胞增殖蛋白异常表达。因此，本研究探讨p16/Ki-67免疫细胞化学双染对HR-HPV阳性患者的分流作用，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2019年9月至2020年5月于上海市闵行区中心医院妇科门诊就诊，初筛为HR-HPV阳性的妇女776例，对其进行以下3项检查：宫颈液基薄层细胞学检测(thinprep cytologic test，TCT)、p16/Ki-67细胞学双染以及阴道镜定位下宫颈活检。本研究获得上海市闵行区中心医院伦理委员会批准(2018-批件-011-01K)，患者经知情告知表示愿意参加本次课题。

纳入标准：(1)年龄25～65岁；(2)有宫颈；(3)有性生活史；(4)身体状况允许进行宫颈癌筛查。排除标准：(1)既往因子宫颈病变或宫颈癌接受过治疗；(2)合并严重影响生命体征平稳的疾病；(3)妊娠期妇女；(4)接诊前48 h内有阴道用药史；(5)接诊前48 h内有性生活；(6)盆腔急性炎症；(7)急性阴道炎；(8)阴道流血；(9)不愿意参加本研究或未进行阴道镜下宫颈活检。

1.2 脱落细胞采集及HPV分型检测 用扩阴器将宫颈充分暴露，将宫颈刷尖端置入宫颈管内，宫颈刷其余部分尽可能覆盖宫颈移行带，用一定的压力按照逆时针或顺时针同方向旋转宫颈刷5～8周。将宫颈刷头推入装有保存液瓶中，宫颈脱落细胞采集完成。脱落细胞用于TCT和p16/Ki-67免疫细胞化学双染检查。采集的脱落细胞用于HPV分型时用HPV专用刷，用同样的方法取材，刷头置于HPV细胞保存液。根据HPV与宫颈癌的关系，将HPV分为低危型、中危型和高危型。

用罗氏聚合酶链式反应技术进行HR-HPV分型，分为HPV16、 HPV18和HPV其他12型(HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型)。

1.3 观察指标及判读

1.3.1 TCT TCT由2位高年资中级职称医师进行判读，如有疑义，由高级职称医师进行复验。细胞学阅片采用2001版the Bethesda System(TBS)描述性诊断系统，结果分为鳞状上皮细胞异常和腺细胞异常。鳞状上皮细胞异常分为未见上皮内病变细胞和恶性细胞(NILM)、无明确诊断意义的不典型鳞状细胞(ASCUS)、不能除外高级别鳞状上皮内病变的不典型鳞状细胞(ASC-H)、低级别鳞状上皮内病变(LSIL)、高级别鳞状上皮内病变(HSIL)和鳞状细胞癌。腺细胞异常分为不典型腺上皮、原位腺癌和腺癌。将ASCUS及以上病变(ASCUS、ASC-H、LSIL、HSIL、鳞状细胞癌、不典型腺上皮、原位腺癌和腺癌)记为细胞学阳性。

1.3.2 p16/Ki-67蛋白双染 p16/Ki-67检测采用罗氏公司的CINtec PLUS技术，结果由2位经过培训的病理科医师判读。p16位于细胞质中，呈棕色染色，Ki-67的位于细胞核内，呈红色染色。1个及以上宫颈上皮细胞内同时存在棕色细胞质染色和红色细胞核染色为细胞学阳性，反之为阴性。

1.3.3 组织学病理 由经验丰富的宫颈专科医师进行阴道镜检查以及活检，活检组织进行苏木精-伊红(H-E)染色和p16免疫组化染色。活检结果由2位高年资中级职称以上医师进行判读，如有疑义，由高级职称医师进行复验。HSIL、宫颈原位腺癌和宫颈癌为组织学阳性(HSIL+)；LSIL、湿疣样变、宫颈慢性炎、宫颈息肉等为组织学阴性(HSIL-)。

1.4 阴道镜转诊策略及HSIL+检出比较 出现以下情况时转诊阴道镜：HPV16/18阳性(策略1)；HR-HPV其他12型阳性且p16/Ki-67双染阳性(策略2)；HR-HPV其他12型阳性且TCT阳性(策略3)。比较3种阴道镜转诊策略宫颈HSIL+的检出率，以及每发现1例HSIL+所需的阴道镜转诊频数，频数=阴道镜转诊例数/HSIL+例数。

2 结 果

2.1 基本情况 776例HR-HPV阳性受试者，HPV16/18型阳性152例，其他12型阳性624例，患者平均年龄为(43.16±12.97)岁。 其中正常或炎性病变430例，LSIL患者272例，HSIL患者65例，鳞状细胞癌9例。

2.2 2种检测方法宫颈病变检出率比较 结果(表1)显示：776例HR-HPV呈阳性受试者中，p16/Ki-67(趋势χ2=141.324，P<0.001)和TCT(趋势χ2=81.328，P<0.001)的检出率均随宫颈病变病理级别的增高而上升。其中，p16/Ki-67对HSIL的检出率明显高于TCT阳性率(72.3%vs47.7%，P=0.004)。

表1 p16/Ki-67和TCT对HR-HPV阳性受试者宫颈病变的检出情况比较 n(%)

2.3 2种检测方法检出HSIL+病变有效性比较 p16/Ki-67显示HSIL+病变阳性56例、阴性18例，TCT显示HSIL+病变阳性37例、阴性37例。结果(表2)显示：与TCT比较，p16/Ki-67预测HSIL+病变有更高的灵敏度(75.7%vs50.0%，χ2=10.445，P=0.001)和阴性预测值(96.9%vs94.1%，χ2=5.482，P=0.019)；2种方法特异度和阳性预测值差异无统计学意义。

表2 2种检测方法检出HR-HPV阳性受试者宫颈HSIL+有效性比较 n(%)

2.4 不同阴道镜转诊策略HSIL+检出情况 在HPV阳性受试者中，转诊阴道镜后检出74例HSIL+患者，结果(表3)显示：策略1与策略2对宫颈HSIL+的检出率相似；策略1每发现1例HSIL+所需的阴道镜转诊频数最少，与策略3差异有统计学差异(χ2=4.41，P=0.036)。

表3 不同阴道镜转诊策略每检出1例宫颈HSIL+所需的阴道镜转诊频数 n(%)

3 讨 论

p16蛋白是一种细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂，参与 pRB介导的细胞周期调控，是细胞周期的制动剂，在G0期表达。当HR-HPV持续感染，而将E7癌基因整合至宫颈上皮细胞时，E7蛋白高表达，破坏pRB与E2F的结合，使其功能受损，进而引起细胞增殖失调，p16的过度表达。有研究[8]认为≥99%的宫颈鳞状上皮内高级别病变及以上组织中p16为阳性，而正常宫颈组织中p16阳性率不到5%。Ki-67是一种标志细胞周期进展及增殖期细胞的核抗原基因，G0期表达缺失，仅在G1、S、G2期和M期表达。因此，一般生理机能正常的细胞中，p16和Ki-67表达不会同时出现。p16和Ki-67在同一细胞中同时被检测到可作为细胞周期失调的标志[9-11]。有研究将p16/Ki-67双染检测应用于细胞学分流[7,12]和HR-HPV分流[13-15]。本研究采用罗氏CINtec PLUS技术，即p16/Ki-67全自动免疫细胞化学双染法，对HR-HPV阳性患者进行分流。结果发现，p16/Ki-67与TCT对HR-HPV阳性受试者宫颈病变检出率随宫颈病变病理级别的增高而上升，与相关研究[16-17]一致。

本研究中，在HR-HPV阳性受试者中，p16/Ki-67与TCT检出HSIL+病变的特异度和阳性预测值相似，但有更高的灵敏度和阴性预测值(P<0.05)，与国内外研究[18-19]结果相符。究其原因可能与以下因素有关：(1)p16/Ki-67免疫细胞双染为在细胞水平进行蛋白检测，而蛋白的变化较TCT形态学的改变更早。(2)p16/Ki-67双染阅片中识别异常细胞时主要根据p16/Ki-67的颜色分布，较根据细胞形态判断容易，只要经过短期培训即可掌握，且不同的阅片医师判断结果之间具有较高的符合度。而TCT阅片主要依赖于细胞形态，缺乏客观指标，细胞学医师经验不足或其他主观因素可导致宫颈癌前病变和宫颈癌的漏诊或误诊[20]。此外，细胞学检查医生的培训、质量控制等都对医疗资源需求较大，使其培训难于免疫蛋白染色。

《基于风险的宫颈癌筛查结果异常的管理共识》[2]指出：对于HPV16/18型阳性受检者，即使细胞学阴性，其发生高级别鳞状上皮内病变和隐匿性癌的风险也较高，建议进行阴道镜检查。根据指南，本研究比较了3种HPV阳性受检者的阴道镜转诊策略，HPV16/18阳性直接转诊阴道镜，HR-HPV其他12阳性且p16/Ki-67双染阳性以及HR-HPV其他12阳性且TCT阳性转诊阴道镜，发现HR-HPV其他12阳性且p16/Ki-67双染阳性转诊阴道镜HSIL+检出率与HPV16/18阳性直接转诊阴道镜相似，但阴道镜转诊率低且每发现1例HSIL+所需的阴道镜转诊频数更少，因此该策略可以减少医疗资源浪费，进而提高经济效益。该结果与Wright等[21]和Uijterwaal等[22]的研究相吻合。因此，在细胞学医师和阴道镜专业医师缺乏的情况下，用该方法能提高宫颈癌及其癌前病变的检出率。

综上所述，p16/Ki-67免疫细胞化学双染操作简单、结果容易判读，具有较好的客观性和可重复性。HR-HPV阳性受检者用p16/ Ki-67分流具有较高应用价值，尤其对于HSIL+病变分流有较高的灵敏度、特异度和较低的阴道镜转诊率。因此，该方法有望成为病理学和阴道镜医师缺乏地区HR-HPV阳性妇女宫颈癌及其癌前病变筛查的新方法。本研究对象为随机抽取的门诊就诊患者，属于机会性筛查，病例相对较少，须扩大HR-HPV阳性受试者p16/Ki-67双染样本量，并进行多中心、群体筛查来进一步证实该方法的有效性。

利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。