杜长大猪CIDEa基因克隆及其组织表达分析

罗云彦，谢红月，潘 鹏，胡旭旭，甄 锐，蒋钦杨，黄艳娜

（广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004）

诱导细胞调亡的DNA片段化因子45样效应物A（）是一种新的促凋亡蛋白家族成员，大部分储存于棕色和白色脂肪中，通过控制脂滴（LDs）融合调节脂肪细胞和其他类型细胞中甘油三酯的沉积。表达量的高低与健康密切相关。基因可以促进哺乳动物细胞中的细胞死亡和DNA片段化，是在具有热生成能力的脂肪细胞中高表达的基因。的C末端可以诱导细胞凋亡，N末端的作用是抑制细胞的凋亡，与脂肪的消耗密切相关。主要定位于内质网、高尔基体、线粒体和LDs表面，是脂质代谢途径的重要调节剂。周林康研究表明，在小鼠及人的脂肪肝发生时，表达显著增加，人肝脏细胞系及小鼠肝脏中过表达能够明显促进脂类的积累。Zhou等研究表明，小鼠肝脏中基因过表达导致肝脂质积累增加和LDs形成。Nordström等研究证实，患有基因缺乏症的小鼠，能够进一步降低肝脏中的脂类积累。Li等研究发现，对于敲除/Fsp27sh双基因的小鼠脂质存储量显著减少。龚婧怡研究表明，在基因敲除后，其发挥的作用缺失，脂肪细胞表达显著受到抑制。

目前关于基因对杜长大猪脂肪沉积的作用鲜有报道。本实验旨在克隆杜长大猪基因并进行生物信息学分析，同时通过qPCR检测杜长大猪不同组织中基因表达规律，明确杜长大猪基因在不同组织中的表达情况，为后续研究基因在杜长大猪脂肪沉积的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取110 kg杜长大猪6头（由广西大学动物科学技术学院科研基地养殖场提供）全部屠宰，在无菌条件下分别采集腹脂、皮下脂肪、肝脏、肾脏、肺脏、心脏及背最长肌等组织，装至标记好的无菌冻存管中，最后整理放入液氮罐中保存备用。

1.2 主要试剂与仪器 胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；PMD18-T载体和荧光定量反转录试剂盒等购自TaKaRa公司；酵母浸出物和胰蛋白胨等购自OXOID公司；琼脂糖购自法国Biowest公司；大肠杆菌DH5感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。分析天平（型号：FB124）购自上海恒平科学仪器有限公司；梯度PCR（型号：T100ThermalCycler）和伯乐Touch qPCR仪（型号：CFX96）均购自伯乐公司。

1.3 引物设计与合成 根据NCBI上猪的基因序列（登录号：NM_001112696.2）利用软件Oligo7设计基因引物。分别设计克隆和定量的引物，并以18S为内参基因。引物信息见表1，由南宁捷尼斯生物科技有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 样品总RNA的提取及cDNA的合成 将样品剪切100 mg于研钵内进行研磨，研磨成粉末状后将其转移到EP管中。利用Trizol法对杜长大猪各组织中总RNA进行提取，以提取的总RNA为模板按照反转录试剂盒反转录成cDNA，置于-40℃冰箱中保存备用。

1.5 PCR扩增 普通PCR反应体系10 μL：2×Taq PCR Master Mix 5 μL；cDNA（500 ng/μL）1 μL，上、下游引物（5.30 nmol/μL）各0.5 μL；RNase-free HO 3 μL。普通PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s、56.4℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35个循环；72℃终延伸5 min；16℃保存。

1.6 电泳和胶回收 将普通PCR扩增产物按照1.5%的比例进行琼脂凝胶电泳；初步判断产物的特异性。对于符合预期产物大小的DNA片段，利用DNA胶回收试剂盒对其片段进行回收。将回收产物与PMD18-T载体进行连接过夜。转化后进行涂布，第2天挑单个菌落于含有LB的EP管中。摇菌后进行菌液PCR扩增，将菌液PCR产物进行琼脂糖凝胶检测。检测结果与目的基因预期一致，将PCR鉴定呈阳性的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.7 生物信息学分析 通过DNASTAR中MegAlign软件对获得的杜长大猪基因序列与NCBI已公布其他物种基因序列进行同源性比较，并构建多物种系统发育进化树。利用EXPASY在线软件分析CIDEa蛋白亲水性、理化性质和等电点。利用NPS＠-SOPMA在线软件分析杜长大猪CIDEa蛋白二级结构，利用SWISS-MODEL在线软件分析蛋白三级结构。

1.8 qPCR检测杜长大猪基因的表达情况 提取杜长大猪组织总RNA反转录为cDNA；以cDNA为模板进行qPCR，每个组织样品进行3次重复。反应体系10 μL：SYBRPremix Ex TaqTM II 5 μL，上下游引物（5 nmol/μL）各0.25 μL，DEPC水2 μL，cDNA（500 ng/μL）2.5 μL。扩增程序：95℃预变性30 s；95℃ 变性5 s、60℃ 30 s，进行45个循环。按照2法计算杜长大猪各组织中基因的相对表达量，采用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行差异分析，利用GraphPad Prism 8.0.1软件对数据进行作图分析。

2 结果

2.1 杜长大猪基因PCR扩增结果 通过PCR方法克隆得到杜长大猪基因CDS序列，其PCR扩增结果如图1所示。将目的基因条带与Maker条带对比，结果表明，目的基因片段长度与预期片段长度829 bp一致。

图1 杜长大猪皮下脂肪CIDEa基因PCR电泳结果

2.2 杜长大猪基因生物信息学分析

2.2.1 杜长大猪基因差异位点分析 通过已公布的野猪基因序列与成功获得杜长大猪基因序列进行对比，结果显示共发生5处碱基突变，分别为第99 C-T、第355 T-C、第609 G-A和第627 C-T属同义突变，第173位T-C脯氨酸突变为亮氨酸。

2.2.2 杜长大猪基因同源性分析 由图2可知，杜长大猪基因与野猪（NM_001112696.2）、牛（登录号：XM_024984288.1）、马（登录号：XM_005 612753.3）、犬（登录号：XM_547681.6）、人（登录号：NM_001279.4）、家鼠（登录号：NM_007702.2）同源性比对，结果显示，同源性分别为99.2%、84.8%、81.5%、80.6%、80%、76.1%。由图3可知，杜长大猪与野猪的遗传距离最近，与家鼠的遗传距离最远。

图2 杜长大猪与其他物种CIDEa基因CDS序列的同源性比对结果

图3 基于CIDEa同源性构建的系统发育进化树

2.3 CIDEa蛋白亲疏水性分析 由图4可知，杜长大猪CIDEa蛋白亲水性平均值为-0.068，属亲水性蛋白。

图4 杜长大猪CIDEa蛋白亲/疏水性预测分析结果

2.4 CIDEa蛋白理化性质分析 由表2可知，CIDEa蛋白分子质量为24 371.48 u，分子式为CHNOS，等电点为9.67，不稳定指数为52.05。杜长大猪CIDEa蛋白中亮氨酸（Leu）含量最高（13.3%），色氨酸（Trp）含量最低（0.5%）。

表2 杜长大猪CIDEa蛋白氨基酸组成

2.5 CIDEa蛋白的二、三级结构 由图5可知，杜长大猪CIDEa蛋白二级结构中-螺旋占45.41%，无规则卷曲占33.49%，延伸链占15.14%，-转角占5.96%。杜长大猪CIDEa蛋白构建的三级结构如图6所示。

图5 杜长大猪CIDEa蛋白二级结构的预测

图6 杜长大猪CIDEa蛋白三级结构的预测

2.6 杜长大猪基因组织表达情况分析 由图7可知，基因在腹脂和皮下脂肪中表达量最高，其次是肝脏、肾脏、肺脏和心脏，背最长肌中表达量最低。

图7 杜长大猪CIDEa基因在不同组织的表达

3 讨 论

脂肪沉积是动物体内能量贮存的主要方式。是脂质代谢各个方面的重要调节因子。本实验通过对已获得的杜长大猪基因序列进行生物信息学分析发现，杜长大猪基因序列与野猪基因序列相比共发生5处碱基突变，其中第173位T-C脯氨酸突变为亮氨酸，该碱基突变是否会影响蛋白质功能有待进一步探究。CIDEa蛋白等电点为9.67，大于7，推测CIDEa蛋白为偏碱性蛋白。CIDEa蛋白不稳定指数为52.05，推测CIDEa蛋白的结构稳定性较差。同时本研究还发现杜长大猪CIDEa蛋白中亮氨酸含量高达13.3%，显著高于其他物种CIDEa蛋白中亮氨酸含量，推测该结果是影响杜长大猪生长快、肉质优良的部分原因。二级结构预测结果显示，CIDEa蛋白的-螺旋含量最高，其次是无规则卷曲，延伸链和-转角含量最低，表明CIDEa蛋白为常规蛋白。考虑到本实验所采用的实验材料存在地区、来源及所选取个体的差异性，因此还需要进一步研究验证。

前人研究表明，基因在各个组织中均有表达，其中在脂肪组织中表达最高。黄柳梅研究肉鸡中基因mRNA的表达量发现，肉鸡中基因在脂肪中表达量最高，其次是肾脏和肝脏。Li等研究梅山猪基因在脂肪、肺、肾、肝、肌肉、心脏等组织的mRNA表达，发现在腹脂和皮下脂肪中mRNA表达量显著高于其他组织。李君等研究豫西脂尾羊基因在皮下脂肪和内脏脂肪组织中的mRNA表达，发现基因在豫西脂尾羊皮下脂肪和内脏脂肪组织中mRNA表达量较高。Qiu等研究肥胖猪和瘦猪的脂肪组织，肝脏和骨骼肌中的基因表达，发现脂肪组织中基因的mRNA表达量显著高于肝脏和骨骼肌。本实验通过对腹脂、皮下脂肪、心脏、肝脏、肾脏、肺脏、背最长肌中基因mRNA表达水平研究，发现基因腹脂和皮下脂肪基因mRNA表达量显著高于其他组织，在肝脏、肾脏、肺脏和心脏较高表达，在背最长肌中表达量最低。此外，基因如何在分子水平上调控脂肪沉积，进而影响机体脂肪沉积以及对相关蛋白的调控机制也有待进一步的研究。

4 结 论

本实验成功的获得了杜长大猪基因CDS区，共发现5处碱基突变，其中第173位由脯氨酸突变为亮氨酸；基因在杜长大猪腹脂和皮下脂肪中表达量显著高于其他组织。本实验结果可为后续研究基因对杜长大猪脂肪沉积的作用奠定基础。