CD68、CD11c和CD163阳性巨噬细胞在乳腺癌组织中表达及与临床病理特征和预后的关系

汪园圆，朱 丹，杜光烨

肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展中起基本作用，肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophage, TAM)作为炎症与肿瘤相关性的重要调节者，是肿瘤免疫微环境中最丰富的免疫细胞，在连接慢性炎性介质反应与肿瘤之间发挥重要的桥梁作用，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移过程，特别是与肿瘤血管和淋巴管的生成密切相关[1-3]。有研究显示TAM有可能成为肿瘤治疗的新靶点，在未来的肿瘤治疗中发挥重要作用[4-5]。TAM可极化并表现出M1或M2表型[6]。其中M1型具有促炎功能，并激活辅助T细胞以诱导针对病原体的致死性T细胞反应，限制肿瘤生长[7]。M2型可产生抗炎细胞因子，参与血管发生和肿瘤进展、淋巴结转移[8]。肿瘤微环境诱导巨噬细胞向M2表型分化，从而促进肿瘤的发展，被认为是肿瘤患者预后不良的重要标志[7-8]。因此，这些TAM种类分布的平衡决定了巨噬细胞成分的抗肿瘤或促肿瘤作用。CD68是通用型巨噬细胞的经典标志物，可识别M1和M2型；CD163是M2型巨噬细胞的高度特异性标志物[9-10]；CD11c近年来被认为是M1型巨噬细胞的标志物[11]。目前，国内尚未见CD11c被用于原发性乳腺癌中TAM标志物的报道。本实验检测81例乳腺癌组织中CD68、CD11c和CD163的表达，通过将肿瘤间质(tumor stroma, TS)中的TAM(M1、M2)进行量化、分组，分析比较两组临床病理特征、生存期的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收集2015年1月～2017年12月上海交通大学医学院附属第九人民医院病理科存档的81例乳腺癌标本，所有患者术前均未行放、化疗及其它相关肿瘤的治疗。患者年龄30～84岁，中位年龄62岁。根据患者的病历和病理报告收集患者的临床病理资料，包括患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、组织学等级和随访数据。按WHO(2012)乳腺肿瘤分类标准及第7届美国癌症联合委员会分期标准对81例患者HE切片进行病理及临床诊断，81例患者均获得随访资料，随访时间5～45个月，中位随访时间35个月。另收集同期50例乳腺腺病石蜡标本作为对照组。

1.2 方法标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，5～6 μm厚切片，常规脱蜡、梯度乙醇入水。95～99 ℃抗原修复液中处理20 min，室温冷却30 min。浓缩型兔抗人巨噬细胞CD68、CD163、CD11c多克隆抗体购自Ventana Medical Systems检测试剂盒，即用型鼠抗人巨噬细胞单克隆抗体和免疫组化试剂盒(EnVision两步法)购自上海杰浩公司。室温下2 h或4 ℃孵育过夜。二抗为室温下孵育30 min。检测CD68、CD163、CD11c表达，分别计数TAM的总量及M1和M2的数量，明确乳腺癌组织中TAM的分化情况。

通过计数阳性巨噬细胞的数目确定CD68、CD11c和CD163的表达。在审查了每种情况下包含核心的TAM载玻片后，选择最大表达强度的区域。在每种情况下，使用ImageScope(Aperio Technologies，Vista公司，USA)选择了阳性TAM浸润密度最高的3个视野，最终放大倍数为400×(1 mm2)。在3个视野中计数阳性巨噬细胞数，仅计数具有单核细胞/巨噬细胞样形态的细胞，取平均值。为进行统计评估，根据截止点在TS中分别对CD68+、CD11c+或CD163+TAM进行计数，按M2/M1比率中位数0.8为界，分为高M2/M1表达组和低M2/M1表达组，分析两组临床病理特征之间的相关性。评估CD68+、CD11c+或CD163+TAM对乳腺癌中TS的影响。

1.3 随访从患者术后出院即开始随访，主要以门诊和电话形式进行随访，随访截至2020年8月31日。总生存期(overall survival, OS)定义为从肿瘤确诊至与肿瘤相关原因或死亡的时间。

1.4 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，样本率的比较采用χ2检验，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。

2 结果

2.1 临床特征81例乳腺癌中，导管原位癌15例(15/81，18.5%)，浸润性导管癌61例(61/81，75.3%)，浸润性小叶癌5例(5/81，6.2%)。组织学分级：Ⅰ级10例(10/81，12.3%)，Ⅱ级59例(59/81，72.8%)，Ⅲ级12例(12/81，14.8%)。TNM分期：T1期15例(15/81，18.5%)，T2期45例(45/81，55.6%)，T3期17例(17/81，21.0%)，T4期4例(4/81，4.9%)。发病年龄30～84岁，中位年龄62岁。接受乳房切除术的患者66例(66/81，81.5%)，接受保乳手术的患者15例(15/81，18.5%)。术后71例患者(71/81，87.7%)行放、化疗或内分泌治疗。所有患者中位随访时间35个月(5～45个月)，其中有13例(13/81，16.0%)死亡，16例(16/81，19.8%)复发或转移。

2.2 TAM在乳腺癌中计数的比较对81例乳腺癌组织进行免疫组化染色，用CD68标记TS中巨噬细胞(图1)；用CD11c标记巨噬细胞，CD11c阳性计数为M1细胞(图2)；用CD163标记巨噬细胞，CD163阳性计数为M2细胞(图3)。样本中M1和M2细胞计数结果见图4，通过统计分析，把TS中M1和M2的分化进行量化，M2/M1的比值结果数值见图5。

①A①B①C②A②B②C③A③B③C

图4 不同乳腺癌患者中TAM及M1和M2细胞数量

图5 不同乳腺癌患者中M2/M1比率

2.3 乳腺癌中M2/M1比率与临床病理特征及预后的关系81例乳腺癌患者，肿瘤体积中位数为31.5 cm3，体积范围2～120 cm3。高M2/M1表达组和低M2/M1表达组在病理分级、AJCC分级方面差异有显著性(P<0.05，表1)。Kaplan-Meier生存曲线结果显示，高M2/M1表达组乳腺癌患者的OS低于低M2/M1表达组，两者差异有显著性(P<0.001，图6)。

表1 乳腺癌中M2/M1比率和临床病理特征的关系

图6 M2/M1比率与乳腺癌患者总生存期的关系

3 讨论

乳腺癌作为威胁女性身心健康的常见肿瘤，是引起女性癌症相关死亡的主要原因，目前全球乳腺癌的发病率呈上升趋势，其发病率位居女性恶性肿瘤的首位[12]。炎症与肿瘤发生、发展具有一定的相关性，TAM作为肿瘤免疫微环境中最丰富的免疫细胞，是炎症与肿瘤相关性的重要调节者，巨噬细胞极化成M1或M2表型会导致细胞因子分泌和功能发生变化。M1巨噬细胞产生IL-12和肿瘤坏死因子，在细胞中具有致命的抗微生物和抗肿瘤作用。M2巨噬细胞产生细胞因子，包括IL-10、Ⅱ型IL-1受体拮抗剂和IL-1诱饵受体。它们调节免疫应答和适应性免疫，并促进血管生成和组织修复。由于IL-10的分泌和转化生长因子-β(TGF-β)，TAM在功能上类似于M2巨噬细胞。通过表达M2巨噬细胞的特征，TAM促进肿瘤的生长和转移[6]。由此可见，M1、M2种类分布的平衡决定了巨噬细胞成分的抗肿瘤或促肿瘤作用，本实验通过标记及计数M1、M2，探寻其与乳腺癌临床病理学参数、预后之间的关系。

CD68是最著名的泛巨噬细胞标志物，通常用作TAM的标志物[13]。既往研究显示，在乳腺癌CD68+TAM高浸润与肿瘤大小和预后不良相关[13-15]；提示乳腺癌与TAM相互作用并诱导支持肿瘤生长的免疫应答。CD68+TAM浸润与乳腺癌、子宫颈癌和膀胱癌的不良预后相关，但与前列腺癌、肺癌和脑瘤的预后良好有关[16]。这些结果可能是由于M1和M2巨噬细胞的CD68表达相似有关。本实验将对CD68+TAM进一步分类标记为M1、M2。

CD163是M2巨噬细胞的最佳标记[9]。既往研究发现乳腺癌中大量CD163+TAM与快速增殖、分化差、ER阴性和导管组织学类型有关，较高的CD163+TAM数量与预后不良、组织学分级高、肿瘤体积较大、Ki-67增殖指数高、ER和PR阴性有关[17-18]。高级别肿瘤可能分泌更高水平的单核细胞集落刺激因子，IL-10和(或)TGF-β，从而导致CD163+TAM数量众多[17]。考虑到M2巨噬细胞通过产生血管内皮生长因子和细胞外基质重塑蛋白在肿瘤进展中起作用[18]，CD163+TAM数目的增加可解释不良的预后。

已知肿瘤浸润的成熟树突状细胞预后良好。然而，未成熟的树突状细胞与预后并不相关[19]。CD11c在与髓样和单核细胞相关的树突状细胞，自然杀伤细胞，巨噬细胞乃至一些活化的B和T细胞中都过表达[20]。在本实验中乳腺癌中M2/M1比率和肿瘤临床指标的关系存在有一定的相关性。高M2/M1染色组和低M2/M1染色组在病理分级、AJCC分级、OS方面差异有显著性(P<0.05)。由此可见肿瘤微环境诱导巨噬细胞向M2表型分化，促进肿瘤发展，是肿瘤患者预后不良的重要标志，而TS中CD11c+TAM可提示预后良好。

本实验检测乳腺癌TS中CD68+或CD163+TAM表达，结果显示两者浸润与临床病理特征相关，并与OS不良有关，TS中CD11c+TAM的浸润与OS良好有关。有研究表明TS中CD68+TAM与临床病理特征或生存相关[14]，而不是肿瘤巢(TN)中的CD68+TAM，这与本实验相似。然而，既往在黑色素瘤中的研究表明，TN中CD68+TAM浸润与较差的OS和无瘤生存期有关[21]。在子宫内膜癌中，TN中CD68+TAM浸润与复发率降低呈正相关[22]。本实验建议在检查恶性肿瘤中的TAM时，还应考虑其定位情况。

综上所述，乳腺癌中包括M2巨噬细胞在内的TAM与肿瘤进展有关。TS中CD68+或CD163+TAM浸润提示乳腺癌患者预后不良，而TS中CD11c+TAM可提示预后良好。此外，除了分析TAM的浸润程度外，了解TAM的位置对于评估患者预后亦很重要。