circHIPK3通过调控miR-124-3p/EZH2促进食管鳞状细胞癌细胞恶性生物学行为

苏 敏，王文祥，唐金明

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，我国食管癌的发病率和病死率分别位居恶性肿瘤的第6位和第4位[1]。我国90%食管癌为食管鳞状细胞癌，患者预后较差，5年生存率约15%[2-3]。因此，发掘食管鳞状细胞癌潜在的治疗靶点具有重要意义。环状RNA(circular RNA, circRNA)是一种共价封闭环状非编码RNA，虽然难以被翻译成蛋白质，但可以调控基因的转录和转录后修饰而发挥重要作用[4-6]。近年研究发现，circHIPK3(hsa_circ_0000284)参与多种肿瘤的发生、发展[7]，如前列腺癌[8]、乳腺癌[9]、胃癌[10]、肺癌[11]、膀胱癌[12]、结直肠癌[13]、卵巢癌[14]等。而目前circHIPK3在食管鳞状细胞癌中的作用及机制尚不十分明确。因此，本文通过检测circHIPK3在食管鳞状细胞癌组织和细胞中的表达，探讨circHIPK3对食管鳞状细胞癌细胞增殖和迁移等生物学功能的影响及可能的分子机制，为靶向circHIPK3治疗食管鳞状细胞癌提供依据。

1 材料与方法

1.1 组织样本收集2017年5月～2018年3月湖南省肿瘤医院行手术切除、术前未接受化疗或放疗患者的食管鳞状细胞癌组织及配对癌旁组织样本(距癌组织>3 cm)42例，样本均经病理检查确诊。其中男性26例，女性16例；年龄47～74岁，平均(61.3±5.26)岁。本实验经湖南省肿瘤医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 实验材料人正常食管上皮细胞系HET-1A及食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-410、KYSE-510购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，湖南省肿瘤医院中心实验室保存。鼠抗人EZH2单克隆抗体购自R&D Systems公司；兔抗人Actin抗体、HRP标记IgG二抗购自成都正能生物公司；转染试剂购自上海吉凯基因科技公司；引物设计与合成由北京擎科生物公司完成；CCK-8试剂盒购自碧云天生物公司；凋亡试剂盒购自诺唯赞生物公司；Trizol试剂、qRT-PCR试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白质定量试剂盒及ECL发光试剂盒购自天根生化科技(北京)公司；Transwell小室购自美国Corning公司；RNA抽提试剂盒购自美国Omega Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1细胞培养 HET-1A、KYSE-410和KYSE-510培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养液中，每隔2～3天消化传代1次，细胞均培养于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中。

1.3.2shRNA慢病毒感染 沉默表达特异性circHIPK3病毒及阴性对照病毒由上海吉凯基因科技公司提供。应用含有针对circHIPK3特异性的shRNA慢病毒感染KYSE-410和KYSE-510细胞作为circHIPK3敲低组，阴性对照病毒感染KYSE-410和KYSE-510细胞作为对照组。

1.3.3qRT-PCR检测 取相应的样本组织或细胞，用Trizol或RNA抽提试剂盒提取RNA，进行定量，再按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。circHIPK3上游引物5′-GGGTCGGCCAGTCATGTATC-3′，下游引物5′-ACACAACTGCTTGGCTCTACT-3′；EZH2上游引物5′-GCCATTATGGACATCGCGGTGC-3′，下游引物5′-CTTCGCGCTCGCGTGCCG-3′；miR-124-3p上游引物5′-GCGGCGGTAAGGCACGCGGTG-3′，下游引物5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。按qRT-PCR试剂盒说明书进行qRT-PCR定量检测。每孔荧光信号达到阈值时经历的循环数为Ct，采用2-ΔΔCt法计算。以GAPDH为内参检测circHIPK3的表达，以U6为内参检测miR-124-3p的表达。实验均重复3次。

1.3.4Western blot法 取适量细胞，裂解提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白含量，调节上样浓度。恒压电泳，半干法转膜，分别以抗EZH2(1 ∶1 000)和Actin抗体(1 ∶5 000)为一抗，以HRP标记IgG为二抗(1 ∶5 000)，ECL发光液显影，凝胶成像系统拍照。

1.3.5CCK-8实验 将细胞按1×103个/孔接种于96孔板，每组设4个复孔，培养24～96 h；于每个设定的时间点每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育1 h；酶标仪于450 nm波长处检测吸光度(OD)值。实验重复3次。

1.3.6划痕迁移实验 将细胞按5×105个/孔接种于6孔板，待细胞融合度达90%时，用10 μL枪头沿直尺垂直划直线。划线后用不含血清的培养基洗涤2～3次，分别于培养0 h和24 h时，显微镜下拍照并测量划痕宽度。实验重复3次。

1.3.7Transwell侵袭实验 将BD Matrigel胶与RPMI-1640培养基按1 ∶5比例稀释，加50 μL稀释的Matrigel胶至Transwell小室上室。将Transwell小室放入37 ℃细胞培养箱中孵育30 min。待胶凝固后，取细胞用无血清RPMI-1640培养基调整细胞浓度至每毫升2×105个，取50 μL加至Transwell小室上室，将Transwell小室置入24孔培养板(预先加入500 μL含10%胎牛血清的1640培养基)；培养24 h后取出小室，用棉签擦去基质胶和小室内细胞，4%多聚甲醛固定10 min，0.5%结晶紫溶液染色15 min；洗脱残余染液，显微镜下观察，随机选取5个视野计数穿膜细胞。实验重复3次。

1.3.8Annexin V-FITC/PI凋亡实验 将细胞接种至6孔板，培养至对数生长期后，收集细胞，PBS重悬，取(5～10)×104个重悬细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，室温避光孵育10 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入10 μL PI，轻轻混匀，冷浴避光放置，上流式细胞仪(BD FACSVerse)检测。实验重复3次。

1.3.9双荧光素酶检测报告实验 将293T细胞培养于96孔板，待细胞密度达50%～70%时，将20 μL DMEM与0.16 μg circHIPK3目的质粒以及5 pmol miR-124-3p/Negative Control充分混匀，再加入0.3 μL转染试剂充分混匀，室温放置。在细胞中加入以上试剂，37 ℃ 5%CO2培养箱中培养。转染6 h后换用新鲜培养基，转染48 h后收集细胞，根据说明使用双荧光素酶测定试剂盒检测荧光素酶活性，使用双荧光素酶报告分析系统检测荧光强度。实验重复3次。

2 结果

2.1 食管鳞状细胞癌组织及细胞中circHIPK3的表达qRT-PCR检测结果显示，circHIPK3在42例食管鳞状细胞癌组织中的表达水平显著高于配对癌旁组织(P<0.001，图1A)；circHIPK3在食管鳞状细胞癌细胞中的表达量均显著高于正常食管上皮细胞：与HET-1A细胞相比，circHIPK3在KYSE410和KYSE-510细胞中的相对表达量分别为3.06±0.47(P=0.017)和3.63±0.41(P=0.008，图1B)。

图1 qRT-PCR检测circHIPK3的表达：A.食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织；B.食管鳞状细胞癌细胞和食管上皮细胞；*P<0.05

2.2 敲低circHIPK3对食管鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响qRT-PCR检测结果显示，circHIPK3敲低组KYSE-410和KYSE-510细胞中circHIPK3相对表达量(0.42±0.03，0.35±0.05)均明显低于对照组(图2)，表明sh-circHIPK3慢病毒感染能显著抑制circHIPK3的表达。

图2 qRT-PCR检测sh-circHIPK3慢病毒感染食管鳞状细胞癌细胞后circHIPK3表达量：*P<0.05

CCK-8检测结果显示，circHIPK3敲低组KYSE-410及KYSE-510细胞增殖能力均显著低于对照组，48 h(P=0.014、0.046)、72 h(P=0.044、0.006)、96 h(P=0.037、0.032)差异均有统计学意义(图3)；Annexin V-FITC/PI检测结果显示，circHIPK3敲低组KYSE-410和KYSE-510细胞的早期凋亡比例均高于对照组(P=0.007、0.009，图4)。

图3 CCK-8实验检测敲低circHIPK3对食管鳞状细胞癌细胞增殖的影响：A.KYSE-410；B.KYSE-510；*P<0.05

图4 Annexin V-FITC/PI实验检测敲低circHIPK3对食管鳞状细胞癌细胞凋亡的影响：A.KYSE-410；B.KYSE-510；C.细胞早期凋亡比例统计图；*P<0.05

2.3 敲低circHIPK3对食管鳞状细胞癌细胞迁移及侵袭的影响划痕实验结果显示，circHIPK3敲低组KYSE-410及KYSE-510细胞划痕愈合度明显低于对照组(P=0.013、0.004，图5)；Transwell实验结果显示，circHIPK3敲低组KYSE-410和KYSE-510穿膜细胞数明显低于对照组(P=0.004、0.006，图6)。

图5 划痕实验检测敲低circHIPK3对食管鳞状细胞癌细胞迁移的影响：A.KYSE-410；B.KYSE-510；C.划痕愈合度统计图；*P<0.05

图6 Transwell实验检测敲低circHIPK3对食管鳞状细胞癌细胞侵袭的影响：A.KYSE-410；B.KYSE-510；C.穿膜细胞数统计图；*P<0.05

2.4 敲低circHIPK3对食管鳞状细胞癌细胞中miR-124-3p和EZH2表达的影响为探讨circHIPK3发挥作用的分子机制，本实验应用在线数据库预测可能与circHIPK3结合的miRNA并结合文献报道，选择circHIPK3/miR-124-3p/EZH2信号通路进行验证。结果显示，circHIPK3与miR-124-3p具有潜在的结合位点(图7A)。对circHIPK3的相应结合位点进行突变，双荧光素酶报告实验验证circHIPK3与miR-124-3p的结合关系，结果显示miR-124-3p mimics+circHIPK3-wt组荧光素酶活性与NC mimics+circHIPK3-wt组相比，差异有统计学意义(P<0.001，图7B)。

qRT-PCR结果显示，与阴性对照组相比，circHIPK3敲低组KYSE-510细胞中miR-124-3p表达水平(3.21±0.49)显著高于对照组(P=0.016，图7C)，EZH2 mRNA表达水平(0.39±0.07)显著下调(P=0.004，图7D)；Western blot分析结果显示，EZH2蛋白表达水平下降(图7E)。

图7 敲低circHIPK3对miR-124-3p和EZH2表达的影响：A.数据库预测circHIPK3与miR-124-3p的结合关系；B.双荧光素酶报告实验验证circHIPK3与miR-124-3p的结合关系；C.qRT-PCR检测敲低circHIPK3对KYSE-510细胞中miR-124-3p表达的影响；D.qRT-PCR检测敲低circHIPK3对KYSE-510细胞中EZH2 mRNA表达的影响；E.Western blot法检测敲低circHIPK3对KYSE-510细胞中EZH2蛋白表达的影响；*P<0.05

3 讨论

我国是食管癌高发国家，发病例数约占全球病例数的一半，其中90%患者为食管鳞状细胞癌且预后不佳[2]。近年来大量研究表明，lncRNA、circRNA等非编码RNA在多种肿瘤中表达异常，可作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤发生、发展等一系列过程[5,15-17]。circRNA参与调控基因的转录和转录后修饰，可能作为肿瘤的标志物或治疗靶点而受到广泛关注[18-20]。circHIPK3来源于同源域结合蛋白激酶3(homeodomain-interacting protein kinase 3, HIPK3)基因的第二外显子，长1 099 bp，且在多种肿瘤的进展中发挥了重要作用[21-22]。Ba等[23]报道circHIPK3在食管鳞状细胞癌组织中高表达，且能通过调控miR-599/c-MYC信号通路促进TE-13细胞的增殖。但circHIPK3在其他食管鳞状细胞癌细胞系中的作用和机制并不清楚，值得深入研究。

本实验发现，circHIPK3在食管鳞状细胞癌组织中高表达，这与Ba等[23]的研究结果一致。此外，circHIPK3在KYSE-410和KYSE-510细胞系中高表达，利用shRNA病毒感染KYSE-410和KYSE-510细胞敲低circHIPK3表达，细胞的增殖、迁移和侵袭均受到抑制，而细胞凋亡比例上升，提示circHIPK3在食管鳞状细胞癌中可能发挥促癌作用。

研究显示，circHIPK3大量存在于细胞胞质中，因此其可能充当miRNA的海绵，通过ceRNA机制影响miRNA靶基因的表达来发挥其调控作用[23-24]。通过生物学分析并结合文献报道，本实验选择circHIPK3/miR-124-3p/EZH2信号通路进行初步验证。文献报道miR-124-3p在肿瘤中发挥重要作用，如miR-124-3p通过调控ITGB3抑制胃癌细胞的迁移和侵袭[25]，miR-124-3p在膀胱癌中低表达且通过调控EDNRB抑制膀胱癌细胞增殖[26]。EZH2基因位于人类染色体7q35上，可编码一种名为组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶的生物酶，是多梳蛋白抑制复合体2(polycomb repressive complex 2, PRC2)的催化活性亚单位，参与组蛋白H3第27位赖氨酸的甲基化修饰进而抑制相关基因的转录[27-28]。EZH2蛋白具有促进细胞增殖和转移、抑制细胞凋亡以及参与耐药等功能[29-30]。本实验结果显示，敲低食管鳞状细胞癌细胞中circHIPK3后，miR-124-3p表达上调，而EZH2 mRNA和蛋白表达水平均下降；荧光素酶报告基因实验也表明，circHIPK3与miR-124-3p有直接结合作用。上述结果提示：circHIPK3可能通过影响miR-124-3p/EZH2信号轴而发挥功能。

综上所述，本实验结果显示circHIPK3在食管鳞状细胞癌中发挥促癌作用，提示circHIPK3可能是食管鳞状细胞癌的潜在治疗靶标。然而，本实验对于circHIPK3对miR-124-3p和EZH2的直接调控作用研究尚浅，circHIPK3在食管鳞状细胞癌中的作用机制还未得到完全验证，本课题组将进一步对circHIPK3在食管鳞状细胞癌中的作用及其调控机制进行深入研究，为其成为食管鳞状细胞癌的治疗靶点提供实验依据。