4种常用消毒剂对布鲁氏菌消毒效果的比较

庞滋东,罗丽君,胡 燕,范司平,刘海峰,周紫峣, 彭广能,沈留红,马晓平,马雪平,钟志军

(1. 四川农业大学动物医学院,四川 成都 611130 ； 2. 解放军总医院第三医学中心检验科,北京 海淀 100039)

布鲁氏菌(Brucella)是革兰阴性、需氧、兼性胞内菌，可导致人和动物感染布鲁氏菌病(简称“布病”，Brucellosis)[1-2]。该病不仅阻碍我国畜牧业健康持续发展，还对公共卫生安全造成巨大威胁，已成为世界上最重要的人兽共患传染病之一[3-6]。布鲁氏菌可经乳汁、粪尿和流产分泌物等排至环境中[7]，并可在土壤、水、肉类食品、粪尿和动物皮毛上存活数天至数月不等[8]。因此，针对布鲁氏菌病的防控，消毒是现代养殖中贯彻“预防为主”方针的关键措施[9-11]。

在诸多消毒方法中，化学消毒法已成为畜牧生产中最常用的消毒方式[12]。有研究表明，不同消毒剂对布鲁氏菌的杀灭效果存在差异[10-11,13-15]，故选择高效消毒剂是养殖场动物布病防控的重要措施。然而，目前针对布鲁氏菌消毒剂的研究相对较少，且多局限于单一种型(羊种、牛种或猪种布鲁氏菌)或单一消毒剂，缺乏多种消毒剂对不同种型菌株的系统研究。此外，近年陆续报道犬种布鲁氏菌感染家畜和人[16-17]，而对其消毒剂的研究罕见报道。因此，本研究选用戊二醛癸甲溴铵、二氯异氰尿酸钠、复合酚和过硫酸氢钾复合粉4种养殖场常用消毒剂，同时对羊种、犬种和猪种布鲁氏菌进行消毒效果比较分析，旨在为养殖场选择消毒剂防控布病提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 羊种布鲁氏菌活疫苗株(B.melitensisM5)[18]、猪种布鲁氏菌活疫苗株(B.suisS2)[18]及犬种布鲁氏菌临床分离株(B.canisY4)[19]均由本实验室保存。

1.2 消毒剂 复合酚(含酚量41%，含醋酸量22%，批号:20200201)，购自湖南大乘医药化工有限公司；戊二醛癸甲溴铵(戊二醛5 g/100 mL，癸甲溴铵5 g/100 mL，批号:20200301)，购自山东圣旺药业股份有限公司；二氯异氰尿酸钠(有效氯含量≥20%，批号:2020317)、过硫酸氢钾复合粉(过硫酸氢钾含量≥10%，批号:2020318)，均购自四川渴望生物科技有限公司。

1.3 培养基及其他试剂 胰蛋白胨大豆琼脂培养基(Tryptic soy agar,TSA)(批号:20190526)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Tryptone soy broth,TSB)(批号:20200815)，均购自青岛日水生物技术有限公司；卵磷脂(批号:20200516)、吐温-80(批号:2020041601)，均购自成都市科隆化学品有限公司；无水硫代硫酸钠(批号：20191912)，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；甘氨酸(批号：191103)，购自西陇科学股份有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 菌悬液制备 将羊种、犬种和猪种布鲁氏菌接种于TSB培养基中，于37 ℃培养96 h后划线接种于TSA培养基中，于37 ℃培养72 h。挑取TSA平板上单个典型菌落接种至TSB培养基中，于37 ℃ 培养72 h得到菌悬液，随后参照文献[20]进行活菌培养计数(CFU/mL)。

1.4.2 消毒剂配制 根据上述4种消毒剂(戊二醛癸甲溴铵、二氯异氰尿酸钠、复合酚和过硫酸氢钾复合粉)产品的推荐使用浓度，用无菌去离子水分别将其倍比稀释10个浓度梯度。戊二醛癸甲溴铵(以戊二醛癸甲溴铵计)：250.00～0.49 mg/L；二氯异氰尿酸钠(以有效氯计)：4 000.00～7.81 mg/L；复合酚(以酚计)：17 493.33～34.17 mg/L；过硫酸氢钾复合粉(以过硫酸氢钾计)：2 000.00～3.91 mg/L。

1.4.3 最低抑菌浓度(MIC)试验 参照文献[20-21]进行最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)试验。用无菌去离子水将菌悬液稀释至1×108CFU/mL。分别吸取2.5 mL各稀释度消毒剂加入到含2.5 mL双倍浓度TSB培养基的10 mL 离心管中，随后取0.1 mL稀释后菌悬液接种于上述含消毒剂的TSB培养基中，作为试验组。用无菌去离子水代替消毒剂进行上述步骤作为阳性对照。向10 mL离心管中加入2.5 mL无菌去离子水和2.5 mL双倍浓度TSB培养基作为阴性对照。上述所有样本于37 ℃培养72 h。

判定标准：3次重复，37 ℃培养72 h后观察抑菌效果，肉汤浑浊判定为有菌生长即阳性，肉汤清澈判定为无菌生长即阴性。阳性对照应浑浊，阴性对照应清澈，否则试验结果不成立。以无菌生长的消毒剂最低浓度为该消毒剂对相应试验菌株的最低抑菌浓度(MIC)。

1.4.4 最低杀菌浓度(MBC)试验 参照文献[20,22-25]配制中和剂并进行最低杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC)试验，复合酚的中和剂为TSB培养基；戊二醛癸甲溴铵为3%吐温-80、0.3%卵磷脂和0.3%甘氨酸；二氯异氰尿酸钠为0.1%硫代硫酸钠；过硫酸氢钾复合粉为1%硫代硫酸钠。用无菌去离子水将菌悬液稀释至5×106CFU/mL。 分别取2.5 mL各稀释度消毒剂加入至10 mL离心管中，随后加入2.5 mL稀释后菌悬液混匀并立即计时，室温作用3、10 min和30 min后分别取出500 μL菌液-消毒剂混合液至4.5 mL含中和剂TSB培养基中，经中和作用10 min后取出500 μL 菌液-消毒剂-中和剂混合液至4.5 mL TSB培养基中，作为试验组。以无菌去离子水代替消毒剂进行上述步骤作为阳性对照，以无菌去离子水代替消毒剂和菌悬液进行上述步骤作为阴性对照。上述所有样本于37 ℃培养72 h。

判定标准：3次重复，37 ℃培养72 h后观察杀菌效果，肉汤浑浊判定为有菌生长即阳性，肉汤清澈判定为无菌生长即阴性。阳性对照应浑浊，阴性对照应清澈，否则试验结果不成立。以无菌生长的消毒剂最低浓度(菌液10 000 g离心2 min，取沉淀于TSA 37 ℃培养3～7 d后无菌落生长)为此消毒剂在该时间内对相应试验菌株的最低杀菌浓度(MBC)。

2 结果

2.1 4种消毒剂对3株布鲁氏菌的MIC 由表1可知，复合酚在17.08、17.08 mg/L和34.17 mg/L即可分别抑制羊种布鲁氏菌(M5)菌株、犬种布鲁氏菌(Y4)菌株和猪种布鲁氏菌(S2)菌株生长，远低于其产品推荐使用浓度最低值。过硫酸氢钾复合粉作用于所有受试菌株的MIC也均低于其推荐使用浓度。然而，当戊二醛癸甲溴铵作用于S2菌株以及二氯异氰尿酸钠作用于Y4菌株和S2菌株时，其MIC则介于相应产品推荐使用浓度最高值和最低值之间。

表1 4种消毒剂对3株布鲁氏菌的MIC结果Table 1 MIC results of four disinfectants against three Brucella spp. (mg/L)

2.2 4种消毒剂对3株布鲁氏菌的MBC 由表2可知，7.81 mg/L戊二醛癸甲溴铵作用3 min即可杀灭羊种布鲁氏菌(M5)菌株，但该消毒剂对犬种布鲁氏菌(Y4)和猪种布鲁氏菌(S2)菌株的MBC均高于其产品推荐使用浓度最低值，并表现为MBC随作用时间缩短而明显增大。二氯异氰尿酸钠对3株试验菌株的MBC均低于该消毒剂推荐使用浓度最低值，其中M5菌株对该消毒剂敏感性最高，其次为Y4菌株和S2菌株。类似地，复合酚对3株试验菌株的MBC均远小于其推荐使用浓度最低值，17.08 mg/L作用3 min即可杀灭M5菌株和Y4菌株，而S2菌株的MBC稍高于上述两者。此外，125.00 mg/L和250.00 mg/L过硫酸氢钾复合粉作用3 min即可分别杀灭M5菌株和Y4菌株，低于其推荐使用浓度。然而，该消毒剂500.00 mg/L浓度作用3 min才可杀灭S2菌株。

表2 4种消毒剂对3株布鲁氏菌的MBC结果Table 2 MBC results of four disinfectants against three Brucella spp. (mg/L)

3 讨论

消毒是养殖场防控布鲁氏菌病的常用方法，选择高效消毒剂杀灭环境中的布鲁氏菌对养殖场防控布病具有重要意义[11]。目前，畜牧生产实践中常用消毒剂主要包括酚类、醛类、酸类、含氯类、过氧化物类、季铵盐类、醇类、碱类和含碘类消毒剂等，它们作用机制不尽相同，对布鲁氏菌的抑菌和杀菌效果也各异[8,22,26]。

本研究选择4种单一/复合消毒剂，包括上述前6种消毒剂种类，结果表明不同消毒剂对同种布鲁氏菌的抑菌/杀菌能力有所差异，而同种消毒剂对不同种布鲁氏菌的消毒效果也不尽相同。其中，戊二醛癸甲溴铵属于醛类和季铵盐类复合消毒剂，试验结果表明其对羊种布鲁氏菌(M5)菌株的抑菌和杀菌效果明显，但对犬种布鲁氏菌(Y4)菌株和猪种布鲁氏菌(S2)菌株的杀菌能力一般，且杀菌效果受作用时间限制。针对S2菌株，该消毒剂15.63 mg/L作用30 min才可将其完全杀灭，与董炳梅等的研究结果一致，即5 mg/L和50 mg/L戊二醛癸甲溴铵对猪种布鲁氏菌作用30 min的杀菌率分别为73%和100%[13]。

属于有机含氯消毒剂的二氯异氰尿酸钠[27]对3株试验菌株的MBC(3.91～31.25 mg/L)均低于其推荐使用浓度最低值(100.00 mg/L)，表明其对受试菌株具有较强杀菌能力。然而，董炳梅等研究发现，90 mg/L二氯异氰尿酸钠对猪种布鲁氏菌作用30 min杀菌率仅为67%[13]，这与本试验结果不符，分析原因可能为消毒剂生产厂家差异或试验菌株差异。

除上述2种消毒剂外，有研究表明复合酚(酚类和酸类)和过硫酸氢钾复合粉(过氧化物类)对多种细菌均具有高效灭菌作用，前者1%浓度或后者0.125%浓度(均以原液计)作用10 min即可杀灭大肠杆菌、巴氏杆菌和葡萄球菌[9,28]。然而，目前未见这2种消毒剂对布鲁氏菌消毒效果的相关报道。复合酚主要由苯酚和醋酸配伍而成，据报道，苯酚在常规使用浓度(0.5%)下对猪种、牛种、羊种布鲁氏菌均不能起到有效的灭菌作用，同时布鲁氏菌对酸存在一定的抵抗力[11]。然而，本试验结果显示，复合酚对3株受试布鲁氏菌的MIC(17.08～34.17 mg/L)和MBC(17.08～136.67 mg/L)均远小于其推荐使用浓度最低值(1 312.00 mg/L)，其较另3种消毒剂具有最强的抑菌和杀菌能力，表明该消毒剂对不同种布鲁氏菌具有广谱高效的消毒作用，可作为布鲁氏菌消毒剂首选。分析原因可能为苯酚与醋酸配伍使用时，前者引起的菌体细胞通透性增加、细胞内组分泄露协同后者导致的菌体蛋白变性共同产生了高效消毒能力[9,22]。

过硫酸氢钾复合粉是由过硫酸氢钾、硫酸钾和硫酸氢钾以一定比例组合而成的一种基于酸性体系的新型氧化类消毒剂[24,29]。结果显示其对M5菌株和Y4菌株的抑菌和杀菌效果均较好，相应MIC和MBC均小于推荐使用浓度，而对S2菌株的MBC则高于前2种菌株，表明过硫酸氢钾复合粉对猪种布鲁氏菌试验株的消毒效果逊于羊种和犬种布鲁氏菌试验株。

本研究结果表明，同种布鲁氏菌对不同消毒剂以及不同种布鲁氏菌对同一消毒剂的敏感性存在差异，复合酚对羊种、犬种和猪种布鲁氏菌的抑菌及杀菌能力最强，消毒效果最佳，二氯异氰尿酸钠、过硫酸氢钾复合粉和戊二醛癸甲溴铵次之。生产实践中推荐复合酚作为养殖场最适合的布鲁氏菌环境消毒剂。