不同光照周期对母兔同期发情和褪黑激素分泌的影响

王文利, 张玉仙,白欣洁,陈耀星,王子旭,董玉兰

(1.北京农业职业学院畜牧兽医系,北京 房山102442 ； 2.中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193)

褪黑激素是一种高度脂溶性激素，广泛分布于植物、单细胞生物、无脊椎动物以及脊椎动物[1-2]。褪黑激素的分泌受到光照的强烈抑制，与黑暗的长度呈正相关[3]，因此血浆中褪黑激素的峰值及持续时间与每天日照时长(光照周期)呈负相关。光周期信号在体内转化为褪黑激素的化学信号[4]，通过褪黑激素动物能够感受光周期的变化，从而能随一年的天气变化有效地调控多种生理过程。季节性繁殖的动物受到一个重要的环境因子影响——光照周期[5]，有研究显示，啮齿类和绵羊等季节性繁殖动物的繁殖行为与褪黑激素的分泌量相关[6]。短日照以及黑暗条件下，禽类的性腺发育受到显著抑制，外源性褪黑激素可以使羔羊提前5周左右性成熟[7]。叙利亚仓鼠是长日照动物,处于短光周期下性腺萎缩、血液性激素水平下降，性活动明显受到抑制,给长光周期下饲养的叙利亚仓鼠注射外源的褪黑激素后，其繁殖活性受到抑制[8-9]。并且松果体摘除后的啮齿类动物性腺及血浆中卵泡刺激素和催乳素几乎不再随光照信号改变，而注射褪黑激素能够抵消松果体摘除的影响[10]。上述研究结果提示，褪黑激素在光周期调控季节性繁殖动物性腺活动的过程中起到了十分重要的作用。

当前，人们生活日益富足，绿色食品越来越受到欢迎，而光照刺激操作简便、造价低廉，能够避免药物残留问题、符合动物福利，因此在家兔养殖的生产实践中合理使用人工光照，对提高家兔生产性能、产品质量，改变传统的饲养模式具有十分重要的生产实践意义。本试验旨在揭示褪黑激素在光照周期调控下对母兔同期发情的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物及分组 未经产的健康的5月龄新西兰母兔由长沙市某生物技术有限公司[许可证号为scxk(湘)2014—0010]提供。48只母兔随机分成长光照组(16-h L/8-h D)、短光照组(8-h L/16-h D)和对照组(12-h L/12-h D)共3个组，每组16只，单笼饲养，每排放4个兔笼，共4层，试验期为16 d。舍内采用人工光照及人工控温，饲养温度维持在(24±2) ℃，自由采食和饮水。

1.2 光源与光照制度 本试验采用的光源为白光(400～700 nm)发光二极管(LED)。光照制度前期采用12-h L/12-h D，饲养10 d后，长光照组转换为16-h L/8-h D，短光照组转换为8-h L/16-h D，对照组保持12-h L/12-h D不变。光源照射到兔眼部的平均光照强度为(80±5) Lx，使用MS6610照度计(上海隆拓仪器设备有限公司)测量试验动物房间光照覆盖面符合试验要求的平均光照强度。饲养至16 d统计发情母兔只数，计算发情率并取材。试验动物处理遵循北京农业职业学院和中国农业大学动物福利和伦理委员会规定。

1.3 主要仪器设备 超低温冰箱(Thermo，美国)；移液器(Eppendorf，德国)；酶标仪(550，BLO-RAD，美国)；高速冷冻离心机(5810R，Eppendorf，德国)；微型离心机(mini-6K，杭州奥盛，中国)。

1.4 主要试剂 褪黑激素ELISA试剂盒(CEA908 Ge，武汉优尔生科技股份有限公司，中国)；0.9%生理盐水；肝素钠(0.05 g肝素钠溶于5 mL 0.9%生理盐水)。

1.5 取材 于转换光照后第7天统计发情率，并分别在各组黑暗的第4个小时进行兔子心脏采血。用75%酒精消毒，左手食指、中指及无名指并拢并在第3、4根肋骨附近轻触兔左胸壁，缓慢移动，在心跳最强烈处停下，右手持10 mL注射器(已吸入0.2 mL肝素)，将针头稍倾斜沿中指刺入胸腔，有血液回流时停止刺入并开始抽血，抽取血液8 mL。采血完成后，立即转入4 ℃，静置6 h后，将上清分装于洁净的500 μL EP管中，保存于-80 ℃备用。

1.6 检测指标和方法

1.6.1 计算发情率 于转换光照后第7天统计各试验组母兔发情只数，然后计算发情率。

1.6.2 血清中褪黑激素含量测定 血清中褪黑激素浓度采用竞争抑制酶联免疫试剂盒测定。原理：微孔板中包被褪黑激素单克隆抗体制成固相载体，同时加入生物素标记的抗原和被测抗原后温育，使两者与特异性抗体竞争性结合。温育后洗涤多余的抗原后加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，温育后洗净加入显色液。显色液在辣根过氧化物酶的催化下显现出蓝色，加入酸后转为黄色。显色的深浅与样品中的待测物质呈负相关。操作步骤严格按照说明书进行。褪黑激素标准品稀释方法见表1。

表1 褪黑激素标准品稀释方法Table 1 Standard dilution for melatonin

测定：用酶标仪在450 nm波长下检测各孔的光密度(OD值)。该试剂盒的检测范围是12.35～1 000 pg/mL；批内和批间的变异系数分别小于10%和12%。血浆中褪黑激素含量用pg/mL表示。每个样品重复3次。试剂盒由武汉优尔生科技股份有限公司提供。

1.7 数据分析 试验结果表示为平均数±标准误。试验数据采用SPSS 22(SPSS Inc,Chicago,IL,USA)单因素方差分析(ANOVA)进行比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 不同光照周期下母兔的发情率 母兔发情时，外阴黏膜由苍白转为红色或紫色、肿胀，分泌黏液。结果如表2所示，经10 d(12-h L/12-h D)的人工光照后，转换为1周的长光照组(16-h L/8-h D)、短光照组(8-h L/16-h D)和对照组(12-h L/12-h D)的人工光照后，长光照组的发情率最高，短光照组发情率最低，长光照组、短光照组和对照组母兔发情的比例分别为81.25%、12.50%和31.25%。

表2 光周期对雌兔发情率的影响Table 2 Effect of photoperiod on the ratio of estrus

2.2 血浆中褪黑激素的浓度 不同光照周期下血清中褪黑激素含量如表3所示，3个组的母兔在12-h L/12-h D的光周期下饲养10 d后，转换光照制度1周后，长光照组、短光照组和对照组血浆中褪黑激素的浓度分别为(115.14±10.52)、(220.65±16.87) pg/mL和(176.50±15.03) pg/mL，长光照组血清褪黑激素水平比对照组显著低34.80%(P<0.01)、比短光照组显著低47.80%(P<0.01)，短光照组血清褪黑激素水平比对照组高25.00%(P<0.05)。

表3 光周期对血浆褪黑激素水平的影响Table 3 Effect of photoperiod on plasma melatonin level

3 讨论

在长期的演化过程中，动物体内的相关生理活动会随着日照长短、温度、湿度和食物等环境因子的改变而发生改变[11]，致使行为、内分泌与生理代谢活动等能够与季节的改变相同步，从而适应环境的变化实现种群的稳定与延续，此过程称为季节性光周期现象。

兔子虽不是严格的季节性繁殖动物，雄性野兔的季节性繁殖行为同样主要受到光周期的调控，同时人工增加光照时间能够提高雌性野兔的性活跃度以及繁殖性能[11-12]。本试验发现，长光照组、短光照组和对照组的发情率分别为81.25%、12.50%和31.25%，光照周期影响母兔发情的效果明显，与Quintela等[11]、Mousa-Balabel等[12]、谭卫国等[13]、王琦[14]的结果一致，从12-h L/12-h D的光周期转换至长光周期下饲养1周后发情率显著升高，而在短光周期下饲养1周发情率显著下降。结果表明光周期能够影响母兔的繁殖活动。

日照时间长短(光周期)在季节性光周期现象中发挥了主要作用[15]。视网膜接收光周期的信息后转换成神经信号经视神经传达至下丘脑，再经由经前神经节最终转换为松果体合成的褪黑激素夜间分泌的峰值和持续时间的化学信号，从而实现光周期对水貂、绵羊、山羊和兔子等多种哺乳动物更换被毛、生殖、体重、免疫系统、甲状腺活动、体温调节、肿瘤的增殖以及更多的一般生理节律的调控[16]。松果体不能储存褪黑激素，褪黑激素合成后立即进入血液循环并迅速进入各种组织和体液，因而血清中褪黑激素的浓度能够时时反映出松果体的活性[17-18]。本试验结果显示，长光照组、短光照组和对照组血清中褪黑激素的浓度分别为(115.14±10.52)、(220.65±16.87) pg/mL和(176.50±15.03) pg/mL，长光照组血清中褪黑激素水平比对照组显著低34.8%(P<0.01)、比短光照组显著低47.8%(P<0.01)，短光照组血清中褪黑激素水平比对照组高25.0%(P<0.05)。结果表明血清中褪黑激素水平与雌性新西兰白兔的性腺活跃度呈负相关，与繁殖期处于长日照时期的季节性繁殖动物如叙利亚仓鼠、黑线仓鼠等动物的现象相似，但与繁殖期处于短日照时期的季节性繁殖动物如绵羊等相反[19-22]。

综上，本试验结果显示，光照周期能明显影响新西兰白兔的发情状态，长光周期能有效诱导新西兰白兔同期发情，短光周期则明显抑制新西兰白兔发情，母兔血清中褪黑激素的水平显著受到光照周期的影响，随光照周期的变化而变化，并且与发情率呈负相关。结果说明光照周期能显著影响母兔的发情率和血清中褪黑激素的水平，由此可见褪黑激素介导了光周期调控母兔发情，具体如何进行调控的还需进一步研究。