禽源大肠杆菌多重耐药机制初探

杨跃飞,马文杰,彭时龙,王鹏勇,王彦红,孙怀昌

(1. 扬州大学兽医学院 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏 扬州 225009 ； 2. 江苏省人兽共患病学重点实验室,江苏 扬州 225009)

禽大肠杆菌病是由某些血清型致病性大肠杆菌(Escherichiacoli)所致禽病的总称，目前已成为危害我国养禽业的主要疾病之一[1]。禽源大肠杆菌血清型非常复杂，有效疫苗研制困难，因此主要用抗菌药物进行防治。目前我国用于禽大肠杆菌病防治的药物种类繁多，临床使用也很不规范，这些抗菌药物的滥用导致耐药菌株不断增加、耐药谱不断扩大[2]。

大肠杆菌耐药机制非常复杂，多重耐药主要与主动外排系统过量表达、菌体细胞膜通透性改变以及耐药性质粒传播有关，其中药物外输作用是重要机制之一[3-4]。大肠杆菌的AcrAB-TolC外排系统是最主要的主动外排系统，其过量表达导致大肠杆菌对四环素、氯霉素、β-内酰胺类和氟喹诺酮类等多种药物产生耐受性[5-6]。soxS是一种多重耐药调控基因，激活多重耐药操纵子marRAB和acrAB等17个基因的表达，正向调控AcrAB-TolC外排泵的表达水平,将细菌胞膜间的药物排出菌体外，从而降低菌体内的药物含量，达到耐药作用[7-9]。soxS基因不会因为动物来源不同发生同源性改变，但会由于抗菌素压力，增加调控能力，目前在犬源、鸡源和兔源大肠杆菌均已发现氨基酸序列发生改变，进一步增强细菌对药物的耐受[10-12]。

使用氟喹诺酮类药物防治动物大肠杆菌病较普遍，由于这类药物的大量使用，导致耐药现象也较严重，质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因传播也是重要的耐药因素。参与氟喹诺酮耐药质粒携带的基因是qnrA、qnrB、qnrS、qepA和aac-(6′)-Ib-cr，质粒携带的aac-(6′)-Ib-cr和qnrS单基因是导致氟喹诺酮类耐药的常见机制[2，13]。

本试验中获得具有多重耐药性的12株禽源大肠杆菌，对其氟喹诺酮类耐药基因和soxS基因进行检测，并对soxS基因进行测序分析，旨在进一步阐明禽源大肠杆菌耐药机制，为禽大肠杆菌病合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 禽源大肠杆菌分离自扬州大学动物医院就诊病禽病料，主要来源于扬州、镇江、盐城等地，病死家禽主要表现为心包炎、肝周炎等症状和病变。利用麦康凯培养基从12份病料分离获得大肠杆菌12株，其中鸡源大肠杆菌7株，鹅源大肠杆菌5株。

1.2 主要试剂 药敏纸片购自杭州微生物有限公司，包括新霉素(NEO)、链霉素(STR)、丁胺卡那霉素(AMK)、诺氟沙星(NOR)、卡那霉素(KAN)、庆大霉素(GEN)、美洛西林(MEZ)、左氧氟沙星(LVX)、多西环素(DOX)、氟苯尼考(FLO)、妥布霉素(TOB)、复方新诺明(TMSZ)、多黏菌素B(POL B)、头孢曲松钠(CRO)和环丙沙星(CIP)；TaqDNA聚合酶等PCR试剂均为TaKaRa公司产品。

1.3 药敏试验 用Kirby-Bauer药敏纸片法进行，无菌挑取麦康凯培养基上单菌落，均匀涂布麦康凯培养基，取药敏纸片贴于琼脂平板表面，37 ℃培养24 h测量抑菌圈直径，参考美国临床实验室标准委员会(NCCLS)药敏纸片扩散法药敏试验标准[14]判定结果。

1.4 PCR引物合成 扩增soxS基因的PCR引物根据标准株K12株大肠杆菌(MG1655)soxS基因序列(GenBank:CP032667.1)设计，扩增氟喹诺酮类耐药基因PCR引物参考文献[15-18]设计(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 试验使用的PCR引物Table 1 PCR primers used in the experiment

1.5 PCR扩增 25 μL PCR 反应体系：10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTP (10 mmol/L) 0.5 μL，TaqDNA聚合酶 (5 U/μL) 0.2 μL，上、下游引物各0.2 μL，模板DNA 2 μL，灭菌双蒸水加至25 μL。扩增soxS基因PCR程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性50 s，48 ℃退火45 s，72 ℃延伸70 s，共30个循环；72 ℃延伸8 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，分别切取目的条带提取DNA，送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定，测序结果用DNASTAR软件进行分析比对。扩增耐药基因的PCR程序参考文献[15-18]进行，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

2 结果

2.1 药敏试验 结果显示，12株禽源大肠杆菌对多西环素、氟苯尼考全部耐药，其中11株对复方新诺明和美洛西林耐药，对链霉素、卡那霉素、头孢曲松、环丙沙星、诺氟沙星、妥布霉素、左氧氟沙星、庆大霉素、丁胺卡那霉素、新霉素和多黏菌素耐药菌株分别为10、8、7、6、6、5、4、4、4、3株和2株。

2.2soxS基因扩增与序列分析 PCR扩增结果显示，12株禽源大肠杆菌均携带soxS基因，部分PCR产物电泳分析结果见图1。将测定序列与K12株大肠杆菌soxS基因序列进行对比分析，部分菌株soxS基因碱基发生变化。将分离株soxS基因序列推导成氨基酸序列，与K12株大肠杆菌soxS氨基酸序列进行比对分析，结果显示，5株发生氨基酸替换，其中4株第12位丙氨酸替换为丝氨酸(A12S)，1株第83位缬氨酸替换为异亮氨酸(V83I)(表2)。

图1 大肠杆菌soxS基因PCR扩增产物的电泳分析Fig.1 Analysis of the PCR amplification products of E. coli soxS gene M：DNA maker； 1～4：PCR产物 M：DNA maker； 1-4：PCR product

表2 12株禽源大肠杆菌soxS氨基酸序列比对分析Table 2 Analysis of soxS amino acid sequence from 12 E. coli strains of avian origin

2.3 耐药关系分析 在12株禽源大肠杆菌中，4株对10种以上抗菌药物耐药，6株对5～10种抗菌药物耐药，2株对5种以下抗菌药物耐药。根据soxS氨基酸序列，将12株大肠杆菌分为A12S、V83I和无突变组，其中3/4 A12S突变株、1/1 V83I突变株、2/7无突变株对环丙沙星、左氧氟沙星和氟苯尼考耐药。在检测的5个喹诺酮类耐药基因中，12株大肠杆菌有2株携带qnrS基因(表3)。

3 讨论

本试验对12株禽源大肠杆菌药物敏感性进行了测试，在测试的8类15种常用药物中，分离菌至少有四重耐药，最严重的对8类药物全部耐药，6株对喹诺酮类药物耐药，11株对磺胺类药物耐药，12株对四环素类药物耐药，与文献报道[11-12，19]的结果基本相似，表明本地区禽源大肠杆菌多重耐药现象严重，并与临床用药关系密切。因此，在禽大肠杆菌病防治时要合理用药，不盲目滥用药物。

PCR检测结果显示，所有12株多重耐药大肠杆菌均携带多重耐药调控基因soxS，此基因正向调控AcrAB-TolC外排泵的表达水平，以达到多重耐药功能，进一步证明soxS基因与禽源大肠杆菌多重耐药的关系更为密切[9]。在7株soxS基因未突变禽源大肠杆菌中，仅2株对环丙沙星和氟苯尼考耐药。但在4株A12S突变大肠杆菌中，3株对环丙沙星、左氧氟沙星和诺氟沙星耐药。已有研究[11]证明，soxS基因突变导致的第12位丙氨酸被丝氨酸替换可导致氟喹诺酮类耐药性增强，主要是soxSA12S突变后表达水平升高，上调acrB基因表达，增强了AcrB外排泵过表达有功能，从而使细菌对氟喹诺酮类耐药性增强[11]。除了soxS在第12位氨基酸发生A12S突变之外，本试验中1株细菌发生V83I突变，其他文献报道了犬源和鸡源大肠杆菌在第102位氨基酸发生突变(Asp-Gly),鸡源大肠杆菌在第101位氨基酸亦发生突变(Ser-Cys)[11]，兔源大肠杆菌在第52位氨基酸发生相同突变(Ala-Thr)[12]。这些突变可能增加细菌对某种抗菌药物耐受性，仍需要进一步探索。

表3 禽源大肠杆菌耐药关系分析Table 3 Analysis on drug resistance in 12 E. coli strains of avian origin

本试验的菌株除了通过soxS基因表达对喹诺酮类药物耐药外，有2株通过qnrS基因增强耐药。在中国地区不同动物来源大肠杆菌携带质粒介导的喹诺酮类耐药基因有所不同，刘晓强等研究发现，猪源大肠杆菌中qnrS是主要流行基因[20]；而Li等研究表明，aac-(6′)-Ib-cr是主要流行基因[21]；孔令超等研究结果表明，鸡源大肠杆菌中qnrS是主要流行基因[22]。在我国动物来源大肠杆菌携带质粒介导的喹诺酮类耐药基因主要是qnrS和aac-(6′)-Ib-cr，本试验结果比较符合喹诺酮类耐药基因流行现状。