植物乳杆菌MG-1半固态发酵豇豆工艺响应面优化研究

张天天，邓后勤，黄娇丽，朱树清，庞 立，易有金，夏 菠

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128；2.汝城县繁华食品有限公司，湖南 郴州424100；3.湖南农业大学 园艺学院，湖南 长沙410128）

豇豆是中国的大宗蔬菜，含有丰富的维生素、蛋白质及微量元素，具有益气健脾、开胃和中等功效，被誉为“蔬菜中的肉类”[1]。其营养价值高、质脆味美，深受大众喜爱[2-3]。

由于豇豆采收后不易贮藏、易萎蔫、褪色和腐烂，所以新鲜豇豆采摘后要及时进行处理[4]。人们通过不同的加工方法对豇豆进行加工和利用，腌渍发酵豇豆因耐贮藏、口味独特而深受大众喜欢[5-7]。但在制作过程中方法不当也会引起一些食品安全问题，如食盐含量过高及亚硝酸盐含量超标等[8-10]。因此，对其发酵方法进行研究，掌握豇豆发酵过程的主要工艺参数及品质变化规律、降低食盐使用量和亚硝酸盐含量，提高豇豆食品的安全性和营养价值具有重要的意义。

以发酵后豇豆的总酸含量、亚硝酸盐含量、维C含量进行加权，综合加权指标X=0.3×总酸含量+0.3×维C含量+0.4×（1/亚硝酸盐含量），以自然发酵做对照，通过响应面曲线对豇豆发酵加工工艺的关键参数进行了优化。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

豇豆，购于湖南农业大学东芝源超市，以无损伤、无腐烂或发霉，新鲜为标准，采收后立即运回实验室进行试验；食盐，购自湖南农业大学东芝源超市；植物乳杆菌MG-1（Lactobacillus plantarum），湖南农业大学食品科学技术学院微生物实验室分离保存，GenBank（MG766279）；氢氧化钠、乙酸锌、冰醋酸、盐酸、亚铁氰化钾、草酸、抗坏血酸、2,6-二氯靛酚，国药集团化学试剂有限公司提供。

1.2 仪器与设备

DK-S48型水浴锅，上海精宏实验设备有限公司产品；WFJ7200型可见光分光光度计，尤尼柯仪器有限公司产品；ZWFR-2112型电热恒温鼓风干燥箱，上海智城分析仪器有限公司产品；LRH-250型智能生化培养箱，上海飞跃实验仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

样品处理所用器具都用0.1%次氯酸钠进行消毒处理。试验原料选择新鲜脆嫩，无腐烂、无发霉的豇豆，清洗豇豆表面的泥沙、污物洗净、晾干；切成2～3 cm的段，且每份样品称取100 g，根据响应面曲线设计的试验，按照不同的植物乳杆菌MG-1接种量、食盐质量分数、水分含量、发酵温度及发酵时间处理豇豆。发酵完成后，测定其总酸含量、亚硝酸盐含量、维C含量并进行综合加权。

1.3.2 响应曲面设计

以Box-behnken法为根据，按照发酵温度、发酵时间、接种量、水分含量及食盐质量分数为自变量，综合亚硝酸盐含量、维C含量和总酸含量作为加权指标，设计五因素三水平响应曲面，优化豇豆植物乳杆菌MG-1发酵工艺，确定最优组合。

响应面试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计

1.3.3 指标的测定

（1）总酸含量的测定。按照国标GB/T 12408—2008进行测定[11]，样品中总酸（以乳酸量计）含量。

（2）亚硝酸盐含量的测定方法。按照国标GB 5009.33—2016进行测定[12]。

（3）维C含量的测定。按照GB 5009.86—2016食品中抗坏血酸的测定方法，采用2,6-二氯靛酚滴定法测定[13]。

综合指标X=0.3×总酸含量+0.3×维C含量+0.4×（1/亚硝酸盐含量）。综合指标值越大代表植物乳杆菌MG-1纯种半固态发酵发酵豇豆效果越好。

2 结果与分析

2.1 响应面优化试验结果

以不同植物乳杆菌MG-1接种量、食盐质量分数、水分含量、发酵温度及发酵时间处理豇豆，以亚硝酸盐含量、总酸含量、维C含量为加权综合指标，确定了5个因素对豇豆发酵效果的影响。试验共有46组，其中有析因点40个，6个零点为中心重复试验，估计误差。

响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验结果

2.2 响应面试验结果分析

采用多元回归分析处理响应面试验结果，结果如表3所示。非线性回归的二次多项式拟合后，得到如下回归模型方程：

回归方程系数显著性检验见表3。

表3 回归方程系数显著性检验

由统计数据可知，该响应面回归模型具有显著性（p＜0.000 1），失拟项的F值不显著（p＞0.05），表明模型与试验预测结果拟合性较好。方程一次项中，食盐质量分数（A）、接种量（B）、发酵时间（E）因素对响应值（豇豆发酵指标）的影响极显著（p＜0.01），方程一次项中，发酵温度因素对豇豆发酵指标的影响显著（p＜0.05）。各因素对指标影响顺序为发酵时间、食盐质量分数、接种量、发酵温度及水分含量。二次项因素均具有显著性（p＜0.01），表明具有显著的曲线关系。

2.3 试验因素相互作用分析

在各试验因素之间，食盐质量分数和发酵时间、接种量和水分含量、接种量和发酵时间、水分含量和发酵温度、水分含量和发酵时间、发酵温度和发酵时间的交互作用对豇豆发酵效果影响均不明显（p＞0.05）。但接种量和发酵温度之间的相互作用效果明显（p＜0.05）。

接种量取恒定值时，响应面综合指标随着发酵温度降低先增加后降低，31℃时获得最大值；若固定发酵温度，响应面综合指标随着接种量的降低先增加后下降，接种量为5%获得最大值。两因素相互作用等高线趋于椭圆形（p＜0.05），说明该相互作用对发酵结果有较大影响。而从等高线的疏密程度可以判断，在该交互作用中，接种量对发酵结果的影响较发酵温度要大。

接种量和发酵温度对响应面指标的影响见图1。

图1 接种量和发酵温度对响应面指标的影响

2.4 验证试验

根据对豇豆纯种发酵指标的二次多项方程求解，得到最佳发酵组合为发酵温度31.09℃，接种量5.10%，食盐质量分数5.59%，水分含量85.56%，发酵时间6.6 d，在此条件下得到的加权综合发酵指标为0.976 6。因此，结合实际情况，确定发酵条件为接种量5%，温度31℃，水分含量85%，食盐质量分数6%，发酵时间7 d，重复3次试验。

接种发酵与自然发酵对豇豆亚硝酸盐、总酸、维C含量、硬度、色差的影响见表4。

由表4可知，接种发酵的亚硝酸盐含量和色差明显明显低于自然发酵；总酸含量、维C含量和硬度均高于自然发酵的结果。因此，植物乳杆菌MG-1纯种半固态发酵豇豆不仅可以保持豇豆良好的脆度和口感，也减少了豇豆营养价值的流失。

3 结论

通过响应面试验，以亚硝酸盐含量、总酸含量、维C含量为加权综合指标，确定了获得最佳豇豆发酵工艺条件。在该条件下制备发酵豇豆可以获得较之前更好的效果，为豇豆高值化利用和附加产品提供了新思路。豇豆发酵加工由自然发酵逐渐向纯种发酵转变。接种发酵的优势菌在发酵过程中起主导菌群的作用[14]。研究的植物乳杆菌MG-1纯种半固态发酵豇豆。结果表明，该种发酵方式不仅可以人为控制自然发酵的诸多不足，所用菌种快速成为优势菌，能够加快发酵速度、减少营养成分损失、保持脆度、降低亚硝酸盐含量，而且还可进一步运用于发酵蔬菜低盐工艺中。