基于灰色关联度分析综合评价不同产地牡丹皮药材质量

张洪坤 黄玉瑶 路丽 杨美华 吴韶辉 高贯彪

(1.亳州市沪谯药业有限公司，安徽 亳州 236800;2.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193;3.广州市中芝源中药有限公司，广东 广州 510925；4.韶关市食品药品检验所，广东 韶关 512026)

牡丹的药用价值自先秦开始体现，明确记载“牡丹”始见于《神农本草经》，之后更多古书典籍中提及牡丹的药用，入药部位为牡丹皮。《中华人民共和国药典》(2015版)一部载，牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，具有清热凉血、活血化瘀的功效[1]，主产于安徽、山东、山西、河南、湖南、湖北、四川、重庆、甘肃、陕西等地。牡丹皮中主含酚类、单萜类等多种成分[2-7]，其成分含量的高低，可直接影响药材质量。灰色系统理论[8-13]在中药质量评价中的应用主要是基于中药样本各指标成分定量数据，建立灰色关联度评价模型，计算评价单元序列与参考序列间的相对关联度，对评价单元进行排序，从而获得评价结果[14-16]。因此，本研究以17个产地牡丹皮药材为研究对象，按2015年版《中国药典》方法测定样品中浸出物和总灰分含量，采用HPLC分析法同时测定样品中7成分含量，基于灰色关联度分析综合评价不同产地牡丹皮药材质量。报告如下。

1 材料与方法

1.1仪器 粉碎机、电子天平(百万分之一，Mettler Toledo)、电子天平(万分之一，Mettler Toledo)、电热鼓风干燥箱，电热恒温水浴锅(上海市一恒科学仪器有限公司)，马弗炉，DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱仪(DAD检测器)、ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(Agilent)。

1.2材料 没食子酸(110831-201605，纯度90.8%，中国食品药品检定研究院)；儿茶素(110877-201604，纯度99.2%，中国食品药品检定研究院)；氧化芍药苷(MUST-16021505，纯度99.93%，成都曼斯特有限公司)；芍药苷(110736-201539，纯度96.4%，中国食品药品检定研究院)；苯甲酸(100419-200301，中国食品药品检定研究院)；丹皮酚(110708-201407，纯度99.9%，中国食品药品检定研究院)；苯甲酰芍药苷(MUST-16061803，纯度99.28%，成都曼斯特有限公司)。甲醇为色谱纯(Merck)；磷酸为色谱纯(阿拉丁)；其余试剂为分析纯。牡丹皮药材于2017年先后自安徽、山东、山西、湖南、湖北、河南、甘肃、陕西、四川等牡丹皮主产区收集，经河南中医药大学张振凌教授鉴定为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，样品来源信息见表1。

表1 不同产地牡丹皮药材来源信息

1.3方法

1.3.1理化指标 按2015年版《中国药典》四部醇溶性浸出物测定法(热浸法)、总灰分测定法测定。结果见表2。

表2 梯度洗脱程序

1.3.2多成分含量测定 本研究参照本项目研究成果《牡丹皮不同采收期质量综合评价研究》[17]、《不同产地牡丹皮规格等级内涵研究》[18]一文中所述的含量测定方法，方法学考察内容不再赘述。(1)对照品溶液制备:取对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，得质量浓度分别为没食子酸0.5 mg/mL、儿茶素0.5 mg/mL、氧化芍药苷0.3 mg/mL、芍药苷1.0 mg/mL、苯甲酸0.5 mg/mL、丹皮酚1.0 mg/mL和苯甲酰芍药苷0.5 mg/mL的单个对照品溶液。分别精密移取上述各对照品溶液适量，加50%甲醇稀释，得质量浓度分别为0.0 036 mg/mL、0.0 030 mg/mL、0.0 126 mg/mL、0.0 194 mg/mL、0.0 020 mg/mL、0.0 501 mg/mL、0.0 051 mg/mL的混合对照品溶液。(2)供试品溶液制备：取过3号筛的样品粉末，约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，回流提取1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。(3)色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；检测器：DAD检测器；检测波长：230 nm，258 nm(氧化芍药苷)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱；流速：1 mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃。在此色谱条件下，取对照品、供试品溶液适量，分别进样10μL测定，HPLC色谱图见图1。

注：A.对照品；B.供试品；1.没食子酸；2.儿茶素；3.氧化芍药苷；4.芍药苷；5.苯甲酸；6.丹皮酚；7.苯甲酰芍药苷。图1 HPLC色谱图

2 方 法

2.1线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液1、3、5、7、10、15μL，在“2.2.3”项色谱条件下进样检测分析，以对照品的量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。见表3。

表3 7种对照品的线性关系

2.2牡丹皮样品各指标成分含量测定 取不同产地牡丹皮样品，分别按“2.1”、“2.2”、项下分析方法测定浸出物、总灰分、以及没食子酸、儿茶素、氧化芍药苷、芍药苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍药苷的含量。见表4。

表4 牡丹皮样品9种指标成分的含量测定结果(n=3)

2.3建立评价牡丹皮药材质量的灰色关联度模式 本研究参照本项目研究成果《牡丹皮不同采收期质量综合评价研究》[17]、《不同加工方法牡丹皮中7种指标性成分的含量测定及质量评价》[19]、及其他文章中所述的灰色关联度方法，进行灰色关联度方法的建立。

2.3.1数据标准化 将原始数据集进行规格化处理。见表5。

表5 不同产地牡丹皮原始数据规格化处理

表6 评价单元序列相对于最优参考序列的关联系数

表7 评价单元序列相对于最差参考序列的关联系数

2.3.3关联度与相对关联度的计算 计算各评价单元相对于最优参考序列和最差参考序列的关联度ri(s)、ri(t)，以及17个批次牡丹皮样品的相对关联度ri，并进行质量排序，结果见表8。

2.3.4牡丹皮药材质量评价 相对关联度ri与牡丹皮药材的质量评价成正相关，ri排序结果可作为药材质量高低评价的依据。由表9可见，17个产地牡丹皮样品的相对关联度在0.314～0.597之间，其中6个产地样品的相对关联度>0.50，5个产地样品的相对关联度在0.45～0.50之间，6个产地样品的相对关联度<0.45，表明不同产地牡丹皮药材质量存在差异。山西运城绛县(S07)、山西运城闻喜(S06)、安徽铜陵(S01)、安徽南陵(S09)和陕西商洛(S15)的相对关联度分别为0.597、0.583、0.546、0.537、0.532，排名前5位。湖北恩施利川(S10)、重庆垫江(S17)、亳州十九里(S03)、亳州五马(S04)、亳州华佗(S02)和山东菏泽(S05)的相对关联度分别为0.414、0.401、0.392、0.381、0.376、0.314，排名后6位。

3 讨 论

本研究建立了HPLC分析法同时测定牡丹皮药材中没食子酸等7成分的含量测定方法，该方法经方法学验证，可用于牡丹皮质量评价研究，为牡丹皮多指标质量控制方法的建立提供一些理论参考。

本次研究共采集了17个产地的牡丹皮药材，以其没食子酸、儿茶素、氧化芍药苷、芍药苷、苯甲酸、丹皮酚、苯甲酰芍药苷、浸出物和总灰分倒数为综合评价指标，采用GRA法处理数据，计算相对关联度作为测度，评价各产地牡丹皮样品，能够相对客观全面地反映牡丹皮药材的内在质量，从而实现牡丹皮药材的合理评价。各产地牡丹皮药材相对关联度：山西运城闻喜>山西运城绛县>安徽铜陵>安徽南陵>陕西商洛>河南焦作孟州>陕西安康>四川达州>湖南邵阳>甘肃永登>甘肃天水>湖北恩施利川>重庆垫江>亳州十九里>亳州五马>亳州华佗>山东菏泽。

本研究结果表明不同产地牡丹皮药材质量存在差异。山西运城产地牡丹皮药材中儿茶素、氧化芍药苷、芍药苷和浸出物含量明显高于其他产地，其药材质量评价关联度最高；安徽铜陵、南陵所产的牡丹皮药材质量排序第3、第4名，说明其药材整体关联度较高，同时安徽铜陵和南陵为牡丹皮的道地产区。

中药牡丹皮是一个复杂的药材，成分的多样性致使其质量很难控制，单一的指标成分不能准确反映中药的药效和质量，使其在分析评价中药的质量时损失信息量太多。而中药质量评价数据的深度挖掘显得尤为重要[20]。灰色关联度分析法可以深度挖掘原始信息下所隐藏的关联，整体性强，适合于分析成分复杂的中药。基于灰色关联分析法的特点，本研究以相对关联度为测度，构建一种牡丹皮药材质量综合评价模型，客观地反映了牡丹皮药材的内在质量，为牡丹皮药材的综合质量评价提供了新思路，求购者可以参考本文的结果根据实际需要选择不同产地的牡丹皮，也为牡丹皮资源的开发利用提供了参考依据。