酵母水解物对吉富罗非鱼生长、免疫力、抗氧化性及抗无乳链球菌感染的影响*

董兰芳 张彩群 刘家辉 郑晓利 童 潼 ①张 琴 王秀华 杨慧赞

(1. 广西民族大学海洋与生物技术学院 广西多糖材料与改性重点实验室 广西高校微生物与植物资源利用重点实验室 广西 南宁 530006；2. 广西海洋研究所有限责任公司 广西 北海 536000；3. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室 青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室 山东 青岛 266071；4. 广西水产科学研究院 广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室 广西 南宁 530021)

酵母水解物也称复合酵母，作为一种新型的优质单细胞蛋白原料，是用内源酶及外源酶水解纯培养酵母而获得的酵母自溶物，富含大量核酸、各类核苷酸、游离氨基酸、小肽及B族维生素，同时含有一定量的细胞壁多糖，是一种新型的功能性蛋白原料(杨凡等,2016)。酵母水解物中游离氨基酸占总蛋白比例在70%以上，细胞壁多糖水解生成的葡聚糖和甘露寡糖为17%～30%，核酸含量为15%以上(聂琴等, 2014)。诸多研究表明，酵母水解物中各类营养性功能物质对养殖动物的生长、免疫力等有积极促进作用。酵母水解物能够解决母猪便秘，提高其幼崽成活率，促进泌乳；能够提高育肥猪的生长和饲料利用，显著提高阶段性营养物质的表观消化率；能够增加幼龄猪进食量，降低腹泻率，提高免疫力，从而促进其生长；适度酶解后，水解物中的功能小肽和游离的氨基酸还能促进猪仔进食(伏润奇等, 2019; 周慧琦等, 2015)。酵母水解物富含大量核酸，而核酸能够调节禽类胃肠道微生物菌群，抑制有害微生物繁殖，促进禽类生长，提高出栏质量，降低料肉比(贺淼等, 2015)。在水产动物方面，学者们研究了饲料添加酵母水解物或部分替代饲料中鱼粉对异育银鲫(Carassius auratus gibelio) (杨 凡 等 , 2015)、 大 菱 鲆 (Scophthalmus maximus) (柳茜等, 2015)和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) (熊家等, 2017)等水产动物的影响。

吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)是我国重要的罗非鱼养殖品种，具有生长快、规格齐、抗病力强等特点。其养殖管理简单，起捕率高，投资见效快，在广东、广西和海南等地已大规模人工养殖，有关在吉富罗非鱼生长过程中添加促生长剂或免疫增强剂的研究较多(汤菊芬等, 2016; 王坛等, 2019)，但饲料添加酵母水解物对吉富罗非鱼的影响未见研究报道。本研究旨在探究酵母水解物对吉富罗非鱼生长性能、免疫力、抗氧化能力及抗无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染的影响，为酵母水解物在罗非鱼养殖生产中的应用提供基础数据和理论指导。

1 材料与方法

1.1 饲料配方与制作

参照罗非鱼的营养需要(National Research Council ,1993)并结合国内实际生产情况设计饲料配方，以豆粕和菜籽粕为主要蛋白源，鱼油和大豆卵磷脂为主要脂肪源，配制成粗蛋白为34.28%、粗脂肪为4.69%的基础饲料，基础饲料配方及营养组成见表1。所有原料粉碎后过60目筛片，按配方将各原料按比例称重，先将粉状原料混合均匀，再加入卵磷脂和鱼油后混匀，之后加水制成湿面团，将湿面团分成小碎块后烘干、粉碎，称取5份等质量饲料，按0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的比例添加酵母水解物(酵母水解物由湖北安琪酵母有限公司友情提供)，分别混匀后加水重新制成湿面团，面团用实验室单螺杆膨化机将饲料制成2.0 mm×3.0 mm的颗粒，饲料调质温度控制在90℃～ 100℃。饲料颗粒于室内阴凉处风干后，保存在-20℃冰箱中备用。共制成5种实验饲料，分别记为对照组、Y0.5%、Y1.0%、Y1.5%和Y2.0%实验组，5种饲料的蛋白含量实测值分别为34.28%、34.31%、34.38%、34.42%和34.51%。

表1 基础饲料配方(%干物质)Tab.1 Composition of the basal diets (% of dry matter)

1.2 实验动物养殖管理

吉富罗非鱼由国家级广西南宁罗非鱼良种场提供。实验在广西民族大学水产养殖多功能实验室进行，罗非鱼先在3 m3的白色大塑料桶内暂养1周，暂养期间饲喂基础饲料。暂养结束后，挑选规格均一、活力好的罗非鱼 450尾 [初始体重为(25.80±0.45) g]，随机分成5组，每组3个重复，每个重复30尾鱼。鱼苗随机分配到室内淡水循环系统中的15个容积为150 L的玻璃缸中。养殖实验持续8周，5个实验组分别饲喂 5种实验饲料，每日按鱼体质量的2%～5%投喂，根据每天各组罗非鱼的实际摄食情况进行适当调整，每天投喂2次，投喂时间为08:00和17:00，每次投喂后2 h内吸除残饵和粪便，每天换水1/3。饲养期间连续充气，水温为28℃～31℃，pH为7.2～7.6，氨氮含量不超过0.05 mg/L，溶解氧含量不低于5 mg/L。

1.3 样品的采集与处理

8周饲养实验结束，停食24 h后，从每缸中随机取 5尾鱼，用注射器从罗非鱼尾静脉采血，置于Eppendorf管中，4℃静置 1 h 后，4℃ 6000 r/min 离心10 min，取血清置于-80℃冰箱备用。剩余的鱼进行称重，计算罗非鱼的特定生长率(specific growth rate,SGR)，计算公式如下：

特定生长率(SGR, %/d)=100 × (lnWt-lnW0)/t

式中，W0和Wt分别为平均初始体质量(initial body weight, IBW)和平均终末体质量(final body weight,FBW)，t为实验天数。

1.4 免疫指标的测定

血清一氧化氮合酶(NOS)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)活性采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒测定。

血清酚氧化酶(PO)活性的测定：参考曹俊明等(2011)的方法略作改动，以L-DOPA为底物，把10 μL血清加入96孔酶标板中，然后向各孔中加入200 μL浓度为0.1 mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液，最后向各样品孔中加入10 μL浓度为0.01 mol/L的L-DOPA，室温下温育10 min后，立刻放入酶标仪中，在490 nm下测定酶活动力学。以实验条件下每毫升样品每分钟OD490 nm增加0.001定义为1个酶活力单位。

血清蛋白浓度测定：采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度(Bradford, 1976)，以牛血清蛋白为标准。

1.5 无乳链球菌攻毒实验

养殖结束后，进行无乳链球菌攻毒实验。攻毒所用无乳链球菌菌种由广西海洋生物技术重点实验室提供。每个重复选择罗非鱼12尾进行攻毒实验，每尾鱼腹腔注射 0.2 mL浓度为 8.3×105CFU/mL的菌液。连续观察14 d，统计累积死亡率(accumulative mortality rate, AMR)。

1.6 数据的统计分析

采用SPSS 19.0软件对实验结果进行统计分析，数据采用平均值±标准误(Mean±SE) (n=3)表示，若差异达到显著(P＜0.05)，则用Tukey多重比较分析各组数据之间的差异。

2 结果与分析

2.1 酵母水解物对吉富罗非鱼生长的影响

由表2可知，各处理组间FBW和SGR存在显著差异(P＜0.05)，随着酵母水解物添加量的增加，FBW和SGR均呈先上升后下降的趋势，并在Y1.5%组达到最大值。虽然各组成活率无显著差异(P＞0.05)，但添加酵母水解物实验组稍高于对照组。吉富罗非鱼SGR和饲料酵母水解物添加量的二次曲线回归方程为y=-0.252 4x2+0.653 4x+1.572 5 (R2=0.957 7)，当 SGR 达到最大值时，对应的酵母水解物添加量为1.29%。

表2 饲料中添加酵母水解物对吉富罗非鱼生长的影响(平均值±标准误, n=3)Tab.2 Effect of yeast hydrolysate on the growth of GIFT tilapia (Means±SE, n=3)

2.2 酵母水解物对吉富罗非鱼血清非特异性免疫酶活性的影响

由表3可知，随着饲料中酵母水解物添加量的提高，罗非鱼血清NOS、PO和ACP活性均呈现不同程度先上升后下降的趋势，且均在Y1.5%组达到最大值(P＜0.05)。

表3 饲料中添加酵母水解物对吉富罗非鱼血清非特异性免疫酶活性的影响(平均值±标准误)Tab.3 Effects of yeast hydrolysate on nonspecific immune enzyme activities of GIFT tilapia (Mean±SE)

2.3 酵母水解物对吉富罗非鱼血清抗氧化酶活性的影响

由表4可知，与非特异性免疫酶相同，罗非鱼血清CAT和SOD活性也随饲料中酵母水解物添加量的提高呈现不同程度先上升后下降的趋势，且均在Y1.5%组达到最大值(P＜0.05)。

表4 饲料中添加酵母水解物对吉富罗非鱼血清抗氧化酶活性的影响(平均值±标准误)Tab.4 Effects of yeast hydrolysate on antioxidant enzyme activities of GIFT tilapia (Mean±SE)

图1 吉富罗非鱼SGR与饲料酵母水解物添加水平的回归分析Fig.1 Regression analysis between SGR of GIFT tilapia and yeast hydrolysate level

2.4 饲料添加酵母水解物对吉富罗非鱼抗无乳链球菌感染能力的影响

由表5可知，饲料添加酵母水解物对吉富罗非鱼抗无乳链球菌感染的能力产生显著影响(P＜0.05)，除Y0.5%实验组外，其他实验组(酵母水解物添加1.0%及以上)罗非鱼的死亡率均显著低于对照组(P＜0.05)，说明酵母水解物能显著提高吉富罗非鱼对无乳链球菌的抵抗力。

表5 饲料中添加酵母水解物对吉富罗非鱼抗无乳链球菌感染能力的影响(平均值±标准误)Tab.5 Effects of yeast hydrolysate on disease resistance to S. agalactiae of GIFT tilapia (Mean±SE)

3 讨论

3.1 酵母水解物对吉富罗非鱼生长性能的影响

酵母水解物对养殖动物影响的研究主要集中于陆生动物，它能够提高鸡、猪、牛等的生长性能和免疫力(付润奇等, 2019; 周慧琦等, 2015; 贺淼等, 2015;Oeztuerket al, 2016; 李建明等, 2015)。近年来，在水产动物中应用的研究也越来越广泛。研究表明，酵母水解物能显著提高加州鲈(Micropterus salmoides)的生长速度和饲料蛋白质效率，提高其饲料利用率，且加州鲈生长性能最优时酵母水解物的适宜添加量为1.51%～1.69% (曾本和等, 2016)。凡纳滨对虾的增重率、特定生长率和蛋白质效率也随酵母水解物添加量的增加而增加，酵母水解物添加量为5%的对虾的生长性能显著高于对照组(熊家等, 2018)。随着酵母水解物添加量的增加，草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的增重率、特定生长率和蛋白质效率均呈先降低后升高再降低的趋势，添加量为1.5%～1.7%时获得最佳生长性能(曾本和等, 2015)。也有研究表明，酵母水解物对某些养殖品种的生长率没有显著影响，如添加0.5%酵母水解物饲料对大口黑鲈(Micropterus salmoides)的生长无显著影响(时博等, 2018)。饲料添加0.1%、0.2%、0.3%酵母水解物，齐口裂腹鱼(Schizotheorax prenanti)的生长性能无显著变化(杨军等, 2019)。添加0.5%、1%、2%酵母水解物，凡纳滨对虾的成活率、增重率与对照组相比，差异不显著(迟淑艳等, 2016)。这可能跟养殖品种的敏感性以及同一品种酵母水解物添加方式和添加量不同有关，5%酵母水解物能显著改善凡纳滨对虾的生长性能，而0.5%～2%添加量对其无显著影响(熊家等, 2018; 迟淑艳等, 2016)。有关酵母产品对罗非鱼生长的研究已有报道，高桂平等(2018)研究表明，饲料添加酵母、酵母RNA、酵母RNA+β-葡聚糖复合物均能提高吉富罗非鱼幼鱼的生长性能，且单独添加0.04%酵母RNA对幼鱼的促生长效果最好；尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长率随饲料海洋红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)添加量的增加呈先增加后降低的趋势(杨铿等, 2016)。与上述研究结果类似，本研究中吉富罗非鱼的生长性能随着酵母水解物添加量的增加而显著提高，添加量为1.5%时，SGR达到最大值；继续加大酵母水解物的添加量，吉富罗非鱼的生长率没有继续提高，反而有一定降低。酵母水解物富含天然核苷酸、小肽、游离氨基酸、葡聚糖、甘露寡糖和B族维生素等营养功能性物质，能补充养殖动物快速生长时期内源核苷酸合成的不足，修复肠道，改善肝功能，促进生长发育(杨凡等, 2016; 聂琴等, 2014)。然而，过多的核苷酸可能对肝脏的脱嘌呤过程造成负担(刘莹等, 2016)，这可能是高酵母水解物添加量实验组吉富罗非鱼生长率有所降低的原因。另外，王永宏等(2013)研究表明，连续投喂β-葡聚糖会使动物机体长期处于免疫激活状态，造成营养物质重分配进而对生长性能造成负面影响。回归分析表明，本实验条件下，吉富罗非鱼酵母水解物的最适添加量为1.29%。

3.2 酵母水解物对吉富罗非鱼血清免疫酶和抗氧化酶活性的影响

本研究中，吉富罗非鱼的免疫酶(NOS、PO和ACP)和抗氧化酶(CAT和SOD)活性均随饲料中酵母水解物添加量的增加而显著提高，在添加量为1.5%时达到最大值，而后出现一定的降低，这与生长率变化趋势一致。酵母水解物富含特有的核苷酸、葡聚糖和甘露寡糖等功能性成分，可能是提高吉富罗非鱼免疫力和抗氧化能力的原因。核苷酸是生物体内遗传物质的基本单位，也是蛋白质合成必需的中间体，在细胞结构、代谢、能量和功能调节等方面具有重要作用(许群等, 2004)。研究表明，饲料添加外源核苷酸能显著提高凡纳滨对虾碱性磷酸酶活力和总抗氧化能力(许丹丹等, 2011)，也能显著提高鳃中PO及血清和肝胰脏中溶菌酶(LZM)活性(曹俊明等, 2011)；酵母核苷酸添加组鲤鱼的血清LZM、SOD和CAT活性显著升高(向枭等, 2011)；外源核苷酸也能显著提高奥尼罗非鱼肝脏内SOD和CAT活力(韩春艳等, 2018)。而β-葡聚糖作为一种新型的天然免疫增强剂，通常以β-1,3-糖苷键为主链，以β-1,6-糖苷键为支链，其特殊的键连接方式和分子内氢键的存在造成螺旋型的分子结构，很容易被免疫系统接受，可以提高鱼类的免疫力(杜建等, 2018; Misraet al, 2006; Aiet al, 2007)。高桂平等(2018)研究证实，β-葡聚糖可提高吉富罗非鱼血浆中SOD、CAT、LZM和ACP活力。另外，酵母水解物富含B族维生素，B族维生素通过提高血清LZM和ACP以及总铁结合力增强鱼类杀菌和抑菌能力，进而增强鱼类非特异性免疫力。因此，酵母水解物能显著提高吉富罗非鱼的免疫力和抗氧化力，但过量添加酵母水解物并不能强化已处于正常状态的免疫系统。

3.3 酵母水解物对吉富罗非鱼抗无乳链球菌感染能力的影响

罗非鱼是无乳链球菌最敏感的宿主，无乳链球菌给罗非鱼产业带来巨大的经济损失(苏友禄等, 2019)。研究表明，鱼类对疾病的抵抗力存在着物种间和个体间的差异，具有良好免疫力的罗非鱼更能抵御无乳链球菌的侵染。朱佳杰等(2015)评估了不同品系罗非鱼抗无乳链球菌病的性能，从感染死亡率来看，奥尼罗非鱼的抗病性能优于其他品系，吉富罗非鱼的感染死亡率最高；饲喂添加植物提取物(樟树皮、平喘草、印楝叶及木瓜种子)饲料的尼罗罗非鱼的免疫力显著高于对照组，无乳链球菌的患病率也显著低于对照组(Kareem et al, 2016)。张永政(2017)研究显示，饲料中添加黄柏(Phellodendron amurense)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和磺胺嘧啶都能不同程度地提高罗非鱼非特异性免疫指标和抗无乳链球菌感染能力。本研究中酵母水解物能显著提高吉富罗非鱼的免疫能力和抗氧化能力，从而表现出良好的无乳链球菌免疫保护作用，显著降低了无乳链球菌感染的累积死亡率，且累积死亡率的降低程度与免疫酶和抗氧化酶活性的提高程度呈正相关，添加量为1.5%实验组的累积死亡率最低。

4 结论

本研究证明，饲料添加酵母水解物可有效提高吉富罗非鱼生长性能、免疫力及抗病力，添加量为1.5%时，效果最显著。酵母水解物作为促生长剂和免疫增强剂，在提高吉富罗非鱼生长性能和抗病能力方面有重要意义。