两头乌猪JAZF1基因的克隆及生物信息学分析

杨 虎 ，徐兴莉 ，饶荣海

（1.宜春学院生命科学与资源环境学院，江西 宜春 336000；2.宜黄县桃陂镇兽医站，江西 抚州 344400）

JAZF1（Ju xtaposed with another zinc finger gene1）基因又名Tip27，ZNF802，最早由全基因组关联研究发现的与人Ⅱ型糖尿病相关的基因，JAZF1基因对动物糖和脂肪代谢有重要调控作用。卢春敏等将JAZF1基因转染到小鼠肝细胞，发现JAZF1基因过表达可以使SREBP1基因表达下调，而SREBP1基因表达产物是脂肪代谢调控的重要转录因子，这些转录因子的调控直接影响脂肪的合成。通过对小鼠研究发现，JAZF1基因过表达能够显著抑制肝脏的糖异生作用。这些研究表明JAZF1是体内脂代谢和糖代谢的重要调控因子。JAZF1基因在动物体内对脂肪代谢分子调控机制还不清楚，而脂肪含量特别是肌内脂肪和肌间脂肪含量是评价动物肉质的重要指标。文章以肌内脂肪含量适中的赣西两头乌猪为研究对象，克隆JAZF1基因的cDNA全长，并对该序列的组成、编码蛋白质的特点进行了生物信息学分析，为探索JAZF1基因调控脂肪代谢机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

组织样品取自赣西两头乌猪的背最长肌，且保存于-80 ℃，5'RACE和3'RACE克隆试剂盒分别购自Invitrogen公司和 Clontech 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA 合成

用反转录酶和特异性引物先合成cDNA第1链，然 后 用RNase Mix 对cDNA处理，最后再纯化cDNA。

1.2.2 PCR扩增

根据GenBank提供的人JAZF1基因（登录号：NM_175061）序列设计PCR引物（表1）扩增并克隆测序，即可获得JAZF1基因部分CDS（coding domain sequence）序列。

表1 引物序列

1.2.3 RACE扩增

1）5'RACE扩增。首先对纯化后的cDNA末端加上多聚C，再用试剂盒特异性引物对已经加尾的cDNA进行第一轮扩增；再用特异性引进行第二轮扩增，电泳检测扩增产物进行并回收，最后将PCR产物与pMD18-T连接，并进行测序，得到长度为684 bp的目的序列。2）3'RACE扩增。 使用试剂盒特异引物及合成的cDNA进PCR扩增，电泳检测并回收，纯化后的PCR产物与载体连接并克隆测序，最终得到420 bp的序列。

1.3 统计分析

1.3.1 JAZF1基因的序列分析

根据克隆测序结果，利用软件DNAstar7.1 预测JAZF1基因的ORF（Open Reading Frame）并预测氨基酸序列。

1.3.2 猪JAZF1基因的蛋白结构与功能预测

分别预测JAZF1氨基酸的磷酸化位点（ http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、潜在的糖基化位点（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）及JAZF1蛋白的亲水性（http://web.expasy.org/protscale/），利用Smart（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析氨基酸序列的结构域。

2 结果与分析

本实验成功克隆了两头乌猪JAZF1基因部分CDS序列，利用RACE技术成功获得了该基因的5'末端序列和3'末端序列。电泳检测5'RACE和3'RACE的两个产物片段，结果如图1所示，两头乌猪部分CDS序列产物长为 620 bp（图1A），5'RACE 产物长 684 bp（图1B），3'RACE 产物长420 bp（图1C）， 回收条带并克隆测序。 最后得到了JAZF1基因的cDNA全长序列，共1 098 bp，包括ORF 732 bp，编码243个氨基酸，氨基酸序列见图2（DNASTAR）。

图1 猪JAZF1基因 1%琼脂糖凝胶电泳图

图2 猪JAZF1核苷酸序列及其推导的氨基酸序列图

2.1 猪JAZF1蛋白结构分析

2.1.1 蛋白理化性质分析

猪JAZF1蛋白分子量为27 079.4 Da，等电点为8.63；JAZF1蛋白的氨基酸中，丝氨酸（Ser）含量为11.9%，所占比例最高，含量最低为蛋氨酸（Met），比例为2.1%。

2.1.2 JAZF1蛋白跨膜螺旋结构

TMPRED分析蛋白跨膜结构，显示猪JAZF1蛋白有1个跨膜结构，且由内向外，跨膜区的氨基酸残基位置在8-25处,见图3。

图3 TMPRED软件预测JAZF1蛋白跨膜结构

2.1.3 JAZF1潜在磷酸化位点和糖基化位点分析

在线分析JAZF1蛋白的磷酸化位点，发现2个苏氨酸（Thr）、3个酪氨酸（Tyr）及18个丝氨酸（Ser）属于蛋白激酶磷酸化位点（图4）； 糖基化位点有19个（图5）。

图4 JAZF1蛋白磷酸化位点

图5 JAZF1糖基化位点

2.1.4 JAZF1蛋白亲疏水性分析

蛋白疏水性分析显示，猪JAZF1基因编码蛋白为水溶性蛋白，如图6所示。JAZF1蛋白疏水性最小值为-2.700，,最大值为1.511，氨基酸序列内大部分属于亲水性氨基酸。

图6 JAZF1氨基酸亲水性分析

2.1.5 蛋白结构域分析及功能预测

结构域显示，猪JAZF1氨基酸残基分别有3个 ZnF-C2H2 的结构域；JAZF1蛋白功能分析结果如表2所示，发现该蛋白在能量代谢、脂肪酸代谢的作用概率明显高于其他功能，蛋白运载结合概率最高为2.030，说明JAZF1基因在脂肪酸代谢和转运中发挥重要作用，可能对调节脂肪的沉积有重要影响。

表2 JZAF1蛋白功能预测结果

3 讨论与结论

JAZF1作为一个新发现的基因，其对糖代谢和脂肪代谢的重要调控作用已经得到证实。糖代谢方面，JAZF1的表达与人的二型糖尿病密切相关，其详细调控机制目前尚不明晰。脂肪代谢方面主要是通过抑制脂肪形成和促进其分解来调控，有研究证实，JAZF1主要是通过抑制细胞内的脂肪酸和甘油三酯的沉积，来提高肝脏脂肪酸的β氧化作用，进而促进脂肪分解。梁艳等研究发现，随着日龄的增加，JAZF1基因在猪肌肉中的表达呈现下降趋势，研究结果显示JAZF1基因在肌肉发育和肌内脂肪沉积过程中发挥着重要调控作用；朱才业对不同品种羊全基因组关联分析，证实JAZF1基因与脂肪形成密切相关。JAZF1的结构域显示该蛋白含有锌指家族中最为普遍的C2H2结构域类型，C2H2结构域根据含锌指结构数量的多少可分为三类锌指蛋白，含3个锌指结构的C2H2型锌指蛋白（tC2H2），含多个C2H2结构的锌指蛋白（maC2H2）；锌指成对间隔排列的 spC2H2 型。猪的JAZF1蛋白结构含有3个锌指结构，属于tC2H2型锌指蛋白，每个锌指由一个螺旋和2个折叠组成，锌指间由接头连接，接头内氨基酸具有保守性，3个锌指在蛋白内串联排列均结合到DNA大沟内。此类结构域通常作为重要的转录调控因子参与表达调控，所以JAZF1蛋白极有可能是参与肌内脂肪沉积的重要调控因子。

蛋白质磷酸化糖基化是最常见、最重要的蛋白质翻译后修饰方式之一，也是一种普遍的生命活动调节方式，在信号传递等过程中发挥重要作用。利用生物信息学软件分析，发现JAZF1蛋白存在18个丝氨酸磷酸化位点，3个酪氨酸磷酸化位点，2个苏氨酸磷酸化位点及19个糖基化位点， 这些位点可能在细胞的信号转导、分化及细胞生长等多个生理过程中发挥着重要作用。JAZF1蛋白功能的预测表明该蛋白对脂肪酸代谢及能量代谢有重要的调节作用，JAZF1基因对脂肪的合成可能有重要影响。