两种隐球菌荚膜多糖抗原试剂盒在肺隐球菌病诊断的比较分析

谢春红 黄连江 厦门医学院附属第二医院 （福建 厦门 361000）

内容提要： 目的：探讨隐球菌荚膜多糖抗原胶体金免疫层析法（CrAg-LFA）检测在非人类免疫缺陷病毒（HIV）患者肺隐球菌病（PC）的诊断价值，比较进口与国产CrAg-LFA试剂在非HIV患者PC患者不同样本中的敏感性。方法：回顾性研究2018年1月1日～2020年12月31日本院呼吸中心收治的518例非HIV疑似PC患者。用两种不同厂家的CrAg-LFA试剂盒检测筛查患者血清和肺泡灌洗液（或防污染保护性毛刷样本、肺穿组织）中的隐球菌荚膜多糖抗原（CrAg），对比两种试剂盒在诊断PC时的敏感性和特异性。结果：确诊的78例PC患者血清进口试剂检测60例阳性，18例阴性；其中进口试剂血清CrAg-LFA检测的敏感性为76.92%，特异性为100%。国产试剂血清CrAg-LFA检测的敏感性为79.49%，特异性为100%。1.两种试剂的敏感性和特异性差异无统计学意义（χ2=0.150，P＞0.05）2.血清标本的敏感性大于肺泡灌洗液标本。结论：CrAg-LFA具有准确率高、快速简便的特点，为PC的快速、早期诊断提供重要依据。国内试剂盒和进口试剂盒在非HIV肺隐球菌患者中不同标本的检测结果无显著差异。

肺隐球菌病（Pulmonary Cryptococcosis，PC）是一种由隐球菌感染引起的肺部真菌病，隐球菌易播散至中枢神经系统而导致隐球菌性脑膜炎，病死率，致残率高。近年来多研究显示，非HIV人群中PC的发病率呈快速增长趋势[1]。CrAg-LFA简单、快速、特异性高、灵敏度高，血清CrAg-LFA检测已广泛运用于临床以辅助隐球菌病的感染。原来国内临床实验室采用都是进口试剂，近年来多家国产试剂不断运用在临床中。本研究回顾性分析过去本院三年来疑似PC患者的资料，探讨CrAg-LFA检测不同标本在非HIV患者PC的诊断价值，比较两种不同试剂盒在非HIV肺隐球菌患者不同标本的敏感性和特异性。

1.资料与方法

1.1 临床资料

收集2018年1月1日～2020年12月31日本院研究最终确诊的PC患者78例，患病年龄为23～76岁，平均（44±15.2）岁，其中男性52例（66.7%），平均年龄（47±12.4）岁，女性26例（33.3%），平均年龄（39±11.5）岁，男女患病年龄没有统计学差异，此次回顾性研究显示，PC的发病率，男性高于女性，因数据基数小不具有代表性。患者中有基础疾病的占36例（46.2%），包括慢性阻塞性肺病、类风湿关节炎、糖尿病、痛风性关节炎、高血压病、慢性乙型病毒性肝炎、肺结核、脑梗死、系统性红斑狼疮、鼻咽癌放疗后，无基础疾病42例（53.8%）。追问病史半年内有鸽子接触史5例。

仪器与试剂：美国Immuno-Mycologies有限公司生产及浙江温州康泰生物有限公司生产的CrAg-LFA试剂；法国生物梅里埃有限公司生产的真菌YST鉴定卡；美国赛默飞公司生产的Versa TREK全自动血培养仪；郑州安图生物有限公司生产的平板。

1.2 方法

1.2.1 IMMYCrAg-LFA检测。常规无菌操作方法收集全血无菌样本，3000r/min离心10min，分离血清，小试管内加入一滴样本稀释液，再加入40μL血清，充分混匀，插入试纸条，放置10min，读取结果。出现一条质控线为阴性，质控线与检测线同时出现为阳性，只出现检测线而无质控线则检测失败。肺泡灌洗液（BALF液）、防污染保护性毛刷样本（PSB样本）、肺穿组织（经研磨后）的检测操作参照血清标本进行操作。

1.2.2 温州康泰CrAg-LFA检测。常规无菌操作方法收集全血无菌样本，3000r/min离心10min得到待测血清后，将待测样本及检测试剂盒置于室温平衡，移取40μL样品稀释液到试管中，然后抽取40μL样品并与稀释液混合，再使用移液器在稀释后抽取60μL样品，并将其添加到测试卡的孔中。等待20min，然后判定结果，出现一条质控线为阴性，质控线与检测线同时出现为阳性，只出现检测线而无质控线则检测失败。BALF液、PSB标本、肺穿组织（经研磨后）操作参照血清标本进行操作。

1.2.3 病理检查。CT引导下经皮肺穿刺活检，组织固定包埋、切片，HE染色及特殊染色。

1.2.4 血培养。采集患者血液进行培养，或CT引导下取肺穿刺物，经玻璃组织研磨器研磨注入血培养瓶并上机培养，阳性瓶立刻用血琼脂平板和沙保罗平板转种，生长后挑取疑似隐球菌的菌落用YST卡鉴定。

1.2.5 镜检和真菌培养。由临床医生收集BALF液、PSB样本及肺穿组织（经研磨）。标本经3000r/min离心10min可直接涂片革兰染色；同时用湿片进行墨汁染色；接种血琼脂平板和沙保氏平板，放入35°C培养箱中培养5d，生长并分纯后用YST卡片进行鉴定。

1.3 统计学分析

检测方法间的比较采用χ2检验，P＞0.05无统计学差异。

2.实验室结果

2.1 BALF、PSB标本或肺穿刺组织标本墨汁染色结果

由临床医生气管镜下收集肺泡灌洗液（BALF）和防污染保护性样本毛刷（PSB）样本，CT定位下穿刺取得肺穿标本（经研磨），3000r/min离心10min，沉渣进行墨汁染色，如在黑色背景镜下可见圆形孢子，周围有一较宽的折光性强的厚荚膜，判断为阳性如下图1、图2，78例确诊患者中有14例墨汁染色阳性，阳性率23.1%。

图1. 不同浓度墨汁染色下的隐球菌

图2. 不同浓度墨汁染色下的隐球菌

2.2 BALF液、PSB标本或者肺穿组织标本真菌培养结果

BALF、PSB标本及肺穿组织（经研磨后）接种于沙保罗平板，放入35°C培养箱内，生长后分纯，可疑菌落用梅里埃的YST卡鉴定。培养出20例隐球菌，通过菌株鉴定，15例为格特隐球菌，其余5例为新生隐球菌。

2.3 气管镜下活检组织或者肺穿刺标本的病理结果

在本次回顾性研究中，78例患者的病理标本的报告中只报告12例隐球菌，肺组织标本中，病理学大部分表现出慢性肉芽肿性炎，肉芽肿由泡沫细胞、上皮样组织细胞、多核巨细胞聚集等构成，常规切片HE染色可以见到呈明显的圆形结构的隐球菌，直径大小大约2～15μm，有白色荚膜，糖原染色荚膜可呈淡红色（见图3）。

图3. 肺穿组织糖原染色下的隐球菌

2.4 CrAg-LFA检测结果

两组患者的BALF液、PSB标本或者肺组织标本检测CrAg-LFA，判断标准参照图4，CrAg-LFA结果见表1，血清标本进口试剂CrAg-LFA检测的敏感性为76.92%，国产试剂CrAg-LFA检测的敏感性为79.49%，两者的特异性均为100%，BALF液进口试剂CrAg-LFA检测的敏感性为65.38%，国产试剂CrAg-LFA检测的敏感性为62.82%，两者的特异性均为99.7%。①进口试剂和国产试剂检测CrAg结果未见明显差异，无统计学意义（χ2=0.150，P＞0.05），结果见表2。②进口试剂血清标本的敏感性大于肺泡灌洗液标本的敏感性，差异无统计学意义（χ2=2.530，P＞0.05），结果见表3。国产试剂血清标本的敏感性大于肺泡灌洗液标本的敏感性，差异有统计学意义（χ2=5.278，P＜0.05），结果见表4。

表1. 两组患者两种标本两种隐球菌荚膜胶体金试剂检测结果及隐球菌培养结果(n)

表2. 两种试剂血清标本隐球菌荚膜胶体金试剂检测结果

表3. 进口试剂血清和BALF隐球菌荚膜胶体金试剂检测结果

表4. 国产试剂血清和BALF隐球菌荚膜胶体金试剂检测结果

图4. 进口和国产胶体金试剂阳性检测结果

3.讨论

近年来PC的报道例数显著增高，是仅次于念珠菌、曲霉菌的第三大类肺真菌病。越来越多的国内、外研究表明近年来隐球菌病在健康人群中的发病率逐年上升，PC在非HIV人群中的发病率甚至超过免疫缺陷患者的发病率，免疫功能正常的PC患者高达62.8%[3]。在非HIV人群中PC发病隐匿，无临床症状，影像学表现没有特异性，血培养、痰培养真菌检出率偏低，有时很难和肺结核、细菌性肺炎、肺癌等疾病相鉴别，误诊率高[4]。本研究对本院2018年1月1日～2020年12月31日的78例非HIV患者确诊PC进行回顾性分析。其中高达53.8%的患者无基础疾病，与既往报道相符，42例无任何临床症状，仅体检时CT发现胸部异常入院，这就考虑隐球菌有相当的毒力，临床需要加强对PC的认识，在健康人群发现肺部疾病时也要考虑隐球菌病的可能性，争取做到早发现、早诊断、早治疗。

感染性疾病主要通过病原学和病理学检查确诊，PC也是如此。PC目前主要依靠肺组织病理检查或者通过血液、BALF液、PSB标本或肺穿刺标本培养出隐球菌，虽然特异性高，但是灵敏度低，而且需要较长时间，并且多为有创性检查，标本获取较难。有研究表明对于诊断隐球菌病，CrAg检测敏感性远高于镜检或者培养或者病理。本研究中只有14例阳性墨汁染色，真菌培养只有20例阳性，与以往相符。这是既往PC误诊率高的主要原因。本研究中的患者常见的感染性指标如白细胞总数、中性粒细胞百分比、C反应蛋白几乎都正常，所有患者的降钙素原也都正常。荚膜多糖是隐球菌的主要毒力因子，它可以抑制中性粒细胞的吞噬，削弱T细胞的免疫应答。CrAg检测主要用于检测脑脊液标本、血清标本中的CrAg，它包括乳胶凝集试验（LA法）、酶联免疫法，胶体金法（LFA）等，CrAg-LFA是一项侧向层析检测技术，国外有研究显示，此法对隐球菌病的敏感度和特异度高达93%～100%，敏感性比LA法高100倍，因此被FDA批准用于血清标本和脑脊液标本的检测。近年多项报道提出胶体金免疫层析法具有人员资质要求低，室温稳定，便捷准确，优于其他学方法，成为检测隐球菌抗原的首选方法[5]。随着胶体金试剂盒的广泛使用，使得PC的检出率剧增。血清隐球菌荚膜多糖抗原检测对诊断PC具有较高的敏感性和特异性。从本研究进口试剂和国产试剂在78例非HIV PC患者血清标本的结果来看，两者的敏感性和特异性无显著差异。