僵蚕水溶性物质指纹图谱及共有峰识别研究

王斯琦, 张露蓉, 陈 伟, 潘韵芝,周 峰, 苏子衡, 程军平

(1. 南京中医药大学附属苏州市中医医院, 江苏 苏州, 215000;2. 江苏省苏州市第五人民医院, 江苏 苏州, 215000)

僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyxmorilinnaeus4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌Beauveriabassiana(Bals.) Vuillant而致死的干燥体[1]。僵蚕药用历史悠久，《神农本草经》[2]中就对僵蚕的功能有了简单介绍: 僵蚕主要治疗惊厥及男子阴疡病。《本草纲目》[3]又全面总结了僵蚕的药效与主治: 治风化痰，散结行经，指甲软薄，治诸血病，散风疾结，小儿疟蚀，月中风痔。现代文献[4-8]记载僵蚕具有祛风止痛、化痰解散、息风止痒等功效。近年来，僵蚕的市场需求量不断提高，但僵蚕品质良莠不齐，直接导致市售僵蚕的化学成分以及含量存在较大差异，影响了后期僵蚕入药的安全性[9]。此外，市场上对僵蚕质量控制还缺少全面、系统的标准，难以对药材进行准确的差异甄别[10]。

水煎法是传统的中药处理方法，临床中对水煎剂的药理作用已有研究，中药水溶性成分的研究不仅是对中药物质基础的研究，也是确定中药水煎剂药理作用的根本[11]。现有文献[12-14]已经建立了僵蚕的指纹图谱方法，但对僵蚕供试品溶液的处理主要采用不同浓度的甲醇或乙醇作为溶剂，对僵蚕中的醇溶性物质进行分析，而僵蚕的水溶剂超声提取方法[15]也仅说明了僵蚕在不同溶剂中化学组分存在差异，并未对其化学成分进行全面鉴定。僵蚕水溶性特征化学成分的识别对于增强其质量控制的专属性及准确性具有重要的意义。本研究在此基础上采用加热回流提取方式对僵蚕进行处理，采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术建立僵蚕水溶性物质的指纹图谱，在19个共有峰中质谱解析出10种化学成分。本研究将LC-MS/MS技术应用于僵蚕的指纹图谱分析中，此分析方法具有科学性、系统性和全面性等优点，可为僵蚕的质量控制研究提供参考价值，同时也可为进一步研究僵蚕水溶性成分药理作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters 公司); AB SCIEX Triple TOFTM5600质谱仪(美国AB公司); Heizbad HBdigit玻璃旋转蒸发仪(德国Heidolph公司); 超声波清洗机(250 W, 40 kHz, 南京先欧仪器制造有限公司); 高速离心机(德国Sigma公司); PL203电子天平(Mettler-Toledo公司); 隔膜真空泵(天津市津腾实验设备有限公司)。

1.2 试剂及样品

试剂: 水(超纯水); 乙腈(色谱纯，赛默飞世尔科技中国有限公司); 磷酸(分析纯，上海联试化工试剂有限公司)。10个批次药材样品均购自苏州春晖九鼎药铺有限公司，批号见表1。

表1 样品来源信息

1.3 方法

1.3.1 色谱条件: 色谱柱为Acclaim PA 25 μm C18(4.6 mm×250.0 mm); 流动相 A为0.2%的磷酸水溶液; 流动相 B为乙腈; 流速为0.2 mL/min; 柱温为30 ℃; 检测波长为265 nm; 进样量为10 μL。洗脱梯度见表2。

表2 流动相梯度洗脱梯度表

1.3.2 质谱条件: 电喷雾离子源(ESI); 正负离子模式检测; 质量扫描范围质荷比(m/z)为50～2 000; 喷雾电压为5 500 V; 解簇电压为100 V; 碰撞电压为40 eV; 碰撞电压差为20 eV; 离子源温度为600 ℃; 雾化器为60 psi; 辅助加热器为60 psi; 气帘气为40 psi。

1.3.3 供试品溶液的制备: 取批号20200129的僵蚕药材供试品适量，粉碎过100目筛，取僵蚕药材粉末约5 g, 精密称定，分别加10倍量的水、8倍量的水加热回流2次, 30 min/次，合并滤液，在30 ℃的旋转蒸发仪下浓缩到25 mL, 提取液在12 000 转/min的高速离心机下离心10 min, 取上清液，即获得供试品溶液。

2 结 果

2.1 僵蚕液相指纹图谱的建立

2.1.1 精密度考察: 将制得批号为20200129的供试品1份重复进样6次，结果显示，共有峰相对保留时间的RSD值为0.21%～0.85%, 均小于1.00%; 峰面积的RSD值为0.46%～4.66%, 均小于5.00%, 符合要求。

2.1.2 重复性考察: 取批号为20200129的样品6份，平行制备供试品溶液，进高效液相色谱(HPLC)仪。结果显示，共有峰相对保留时间的RSD值为0.15%～0.75%, 均小于1.00%; 峰面积的RSD值为0.85%～4.57%, 均小于5.00%, 符合要求。

2.1.3 稳定性考察: 取制得批号为20200129的供试品1份，于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD值为0.14%～0.87%, 均小于1.00 %; 相对峰面积RSD值为1.10%～4.71%, 均小于4.71%, 符合要求。

2.2 僵蚕药材指纹图谱的建立及相关分析

2.2.1 指纹图谱的建立及共有峰的指认: 按照上述确定的色谱-质谱条件，测定10个批次不同产地僵蚕的色谱质谱联用技术的指纹图谱。色谱中各物质的分离度良好，含量较高，所以选其作为僵蚕药材质量和活性物质的指标。依据国家药典委编写的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》，采用S1作为参照图谱，选择时间宽度为0.1, 生成色谱峰方法为中位数，生成对照图为R, 选用多点校正方式对其共有峰进行校正，并确定了19个共有峰。HPLC指纹图谱的生成: 选择编号从S1～S10共10个批次僵蚕药材的色谱图生成的HPLC重叠图谱见图1，软件生成的对照HPLC-质谱指纹图谱见图2。

2.2.2 指纹图谱相似度评价: 将10个批次僵蚕药材的指纹图谱导入软件，计算10个批僵蚕药材指纹图谱的相似度值，其相似度值为0.985～1.000, 见表3。

表3 10批僵蚕样品HPLC指纹图谱的相似度

2.2.3 僵蚕药材中共有峰识别及成分鉴定: 采用LC-MS/MS联用技术，按上述条件对样本进行分析，得到了僵蚕水提物共有峰的液质联用数据，见表4。僵蚕药材中主峰化合物的分子结构图见图3。僵蚕的液相色谱图正离子和负离子模式下的质谱总离子流图见图4。

表4 僵蚕水提物共有峰的HPLC-MS/MS分析

3 讨 论

本实验通过DVD检测器对僵蚕供试品溶液进行检测，考虑色谱峰的分离度及基线的稳定性等情况，发现265 nm为最佳检测波长。同时，本实验对色谱条件进行优化，考察了不同温度(25、30 ℃)及不同流速(0.2、0.5 mL/min)条件下对色谱峰的影响，发现30 ℃下的色谱峰信号响应值高、峰面积大，且分离度更好；液质的流速一般不宜过大，流速大容易导致溶剂效应，因此流速选择0.2 mL/min。本实验又对甲醇、乙腈作为有机相以及醋酸、不同浓度磷酸水(0.1%、0.15%、0.2%)作为流动相进行考察。结果发现0.2%的磷酸水溶液-乙腈下色谱峰分离度最好且基线平稳。因此最终确定本实验的条件为0.2%的磷酸水溶液-乙腈, 265 nm的波长, 30 ℃的柱温, 0.2 mL/min的流速。

国内外研究[18-19]发现僵蚕中含有多种化学成分，包括蛋白质、氨基酸和微量元素等，具有很高的药用价值，有抗凝、抗血栓、抗癌、镇定催眠和降糖降脂等作用。但是僵蚕生品不宜入药，因生药材具有较强的腥臭味，药效较强，容易造成恶心、干呕，不仅会刺激横轴的胃肠道，还增高了过敏的风险。因此，一般僵蚕炮制后入药。研究[20]报道，僵蚕的炮制方法一般为麸炒等。汤剂作为中国使用最早的剂型，其在辨证施治及随症加减时具有较强的适应性，制备工艺简单，药效发挥迅速，应用广泛。中药通过在水中加热沸腾以后再转小火进行煎熬，可用于调节经络，祛除疾病，且副作用小[21-23]。因此，除麸炒外，僵蚕的炮制方法还可采用传统的水煎法，但尚无文献对僵蚕水溶性物质进行研究。

本实验在传统的制备工艺基础上对僵蚕中水溶性成分进行分析，为进一步探究其药效物质基础提供依据。本实验建立了LC-MS/MS色谱技术，对僵蚕中水溶性成分进行快速分析。近年来, LC-MS/MS等技术被应用于化学成分的分析与鉴定，该技术结合了色谱的强分离性以及质谱的强定性优势，广泛地应用于缺对照品的情况下对色谱峰鉴定[24-25]。本实验将僵蚕水浴回流提取样品经过液相色谱分离后电喷雾质谱方法检测，通过分子离子峰确定共有峰可能的相对分子质量，推测出僵蚕药材中10种化学成分的归属及结构。僵蚕水溶性成分中核苷类成分最为丰富，确认出腺嘌呤、尿嘧啶、β-胸苷、尿苷和腺苷。除此之外，本实验还鉴定出少量肌酐、黄酮类的槲皮素以及甾体类的β-谷甾醇。虽然僵蚕水溶性成分中核苷类成分较多，但其中识别出含量最高的成分为草酸铵，该成分可用于僵蚕药材的定性鉴别。总之，本实验建立了僵蚕水溶性的LC-MS/MS指纹图谱，该方法稳定性好、信息量丰富，在对僵蚕进行质量控制方面具有重要意义。