陶 喆,王玉鹏,黎威巍,陈舒丽,单士刚,包永芬**
(1.湖北科技学院药学院,湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院临床医学院;3.湖北科技学院基础医学院)
5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)在中枢和外周神经系统中起到调节因子的作用,近年来的研究发现它也影响T和B细胞的功能,从而对免疫系统产生影响。5-HT运载蛋白对5-HT具有关键调控作用,并且在免疫细胞广泛表达。5-HT运载蛋白启动子区多态性与人的精神抑郁状态存在关联[1-4]。银屑病是一种复杂性疾病,发病机制涉及遗传、免疫、内分泌等因素。鉴于银屑病是一种在某种程度上由自身免疫系统慢性调节障碍导致的炎症性皮肤过度增生性疾病和病人一般有精神状态抑郁的特征,本研究重点从分子水平分析银屑病病人5-HT运载蛋白启动子区多态性与正常人此区域的多态性,以期验证5-HT运载蛋白启动子区多态性与银屑病的相关性。
①湖北地区、汉族;②无银屑病等自身免疫性疾病家族史;③所有参与研究的个体间无亲缘关系,无任何符合诊断标准的精神疾病,既往无精神疾病及家族病史;④患者典型临床表现为红斑、鳞屑等,除此之外还包括Auspitz征等典型表现,病史为反复发作、迁延不愈。
参与本研究的寻常型银屑病患者(观察组)均选取自2015年9月至2016年12月在湖北科技学院附属医院皮肤性病科和中国人民解放军一九五医院皮肤科就诊的患者。100例中男50例,女50例;平均发病年龄(43±11)岁;汉族。
所有健康对照选取自同一时期本院职工和大学生志愿者150名,其中男75名,女75名;平均年龄(32±12)岁。同样由参与者或其监护人在知情同意书上签字,经由专业流行病调查员记载资料。
1.3.1 DNA采集
含有抗凝剂(EDTA)的采血管抽取5mL静脉血,保存于-20℃冰箱备用。提取DNA用相应的试剂盒,目的基因位点用PCR扩增,用浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳验证相关的基因型。
1.3.2 引物设计
在www.ncbi.nlm.nih.gov网站上下载5-HTTLPR的基因序列。使用primer 5.0进行引物设计:5-HTTLPR位点上游引物:5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA AC-3',下游引物:5'-GCA GCA GAC AAC TGT GTT CAT C-3'。
1.3.3 反应体系及扩增条件
优化的PCR反应体系如下:
体系体积10×缓冲液2μL25mmol/L MgCl21.5μL2.5mmol/L dNTP1.6μL10μmol/L 5-HTTLPR上、下游引物1.0μL5U/μL Pfu酶0.5μL100ng/μL DNA 模板1μL补充ddH2O至适当体积体系总体积20μL
优化的PCR反应步骤:预变性(95℃)5 min;35个循环如下:94℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 60s;最后72℃延伸10min。把以上PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳,拍照并分析结果。
1.3.4 基因型鉴定
根据电泳结果分析个体的基因型,在2%琼脂糖凝胶中每孔加入15μL扩增产物,电泳时所用电压为80V,根据条带位置终止电泳(美国BIO-RAD电泳仪)。凝胶经核酸染料染色后,在成像仪中观察并拍照记录结果。
整理该研究中的实验数据,使用SPSS 13.0统计软件进行相关的数据分析。方法包括频数分析、Hardy-Weinberg平衡定律(H-W定律)的吻合度检验、χ2检验等。
经统计分析,5-HTTLPR位点观察组(χ2=2.393,P>0.05),对照组(χ2=0.867,P>0.05);5-HTTVNTR 位点观察组(χ2=1.253,P>0.05),对照组(χ2=0.268,P>0.05),观察值与期望值吻合度良好,均符合Hardy-Weinberg定律。说明样本具有群体代表性,资料可靠。
通过设计的相关引物,PCR后电泳检测到两个条带:528bp(Long,L)和485bp(Short,S),即可分为L/L、L/S和S/S 3种基因型。见图1。
L/L基因型:1、8、11;L/S基因型:2、3、4、5、6、7、10、12;S/S基因型:9
3组基因型频率在总体分布上两组差异无统计学意义(χ2=4.53,P>0.05)。见表1。
表1 5-HTTLPR各等位基因及基因型频率的分布
观察组和对照组比较,性别基因型分布无明显差异(P>0.05)。见表2。
表2 5-HTTLPR 基因型按性别分层后的分布
5-HT又名血清素(serotonin),主要是由嗜铬细胞分泌的色氨酸衍生,作为一种体内非常重要的神经递质,其主要的生理学功能包括调控痛觉、体温和睡眠等,其发挥作用的机制是通过与细胞膜上的相应受体结合。1984年Slauson等[5]研究表明5-HT具有调节淋巴细胞免疫抑制功能,并在免疫系统中也有明显的作用。5-HT与过敏性疾病、肿瘤和精神神经类疾病发生与治疗有一定联系,尤其是神经精神类疾病,它作为免疫调节因子调控机体神经免疫调节网络,在神经系统中发挥作用。目前发现,其发挥免疫调控作用的机制可能是与免疫细胞表面存在的受体有关,5-HT通过与细胞表面的不同受体结合,发挥相应的免疫调节功能[6]。
5-HTT定位于神经突触前膜,能够对存在于突触间隙的5-HT进行再摄取,从而影响5-HT在突触间隙的含量,由此调控中枢5-HT系统和外周5-HT效应,而产生相应的生物学效应。5-HT转运体的蛋白表达受其基因多态性影响,进而导致5-HT的改变。人类5-HT转运体由单基因编码(SLC6A4),该基因定位于17q11.1~17q12区,由14个外显子构成编码序列,与5-HT转运体相关的基因多态性区有3个,其中研究最多的是5-HTTLPR。位于转录启始位点上游的1kb处,包括2种等位基因,两者相差44个碱基对,插入或缺失形成L型(长)和S型(短),由此在不同的个体中可能会出现三种基因型:LL型(纯合子插入),LS型(杂合子插入/缺失),SS(纯合子缺失)[7]。不同的基因型会影响5-HT转运体基因mRNA水平和蛋白表达能力,L等位基因比S等位基因的基础转录效率要高一些,从而引起重摄取5-HT的活力提高。在淋巴母细胞中,Hranilovic等[8]研究发现LL基因型细胞表达5-HT转运体mRNA水平比含S等位基因的细胞提高约30%左右,同样的研究被Heils等[7]证实:LL基因型含5-HT转运体数量比LS或SS基因型多30%~40%,并且重摄取5-HT的量是LS或SS基因型的2倍左右[9]。由此可以推断有些疾病的发生发展可能和该基因的基因型有关联,但是我们通过研究发现5-HTTLPR三种基因型在观察组分布上与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05),同Mössner的研究一致[10],同时我们还进行了性别分层后的比较,研究发现男、女银屑病组和正常组比较,基因型分布无明显差异(P>0.05)。这些研究表明5-HTTLPR的多态性与银屑病没有相关性,它可能通过其他的机制调控疾病的发生。
由此推断具有不同5-HTTLPR基因型的人可能在5-HT的摄取及对阻断5-HT摄取药物的反应有所不同。5-HTT基因型对5-HTT表达的调控作用还影响到人类患焦虑-抑郁谱障碍的易感性及对环境应激的适应性。临床研究表明,5-HTTLPR的2个等位基因与心境障碍、人格特征、精神分裂症、物质依赖、广泛性焦虑障碍等具有相关性或连锁不平衡,但各研究结果之间有矛盾之处[11-17]。虽然本研究的5-HTT基因型与疾病没有相关性,但是后续我们还将开展该基因其它位点的多态性与疾病的关联,以期从遗传学的角度阐述银屑病的发病机制。