三维培养牙髓间充质细胞外泌体微小RNA表达谱分析

艾晓青 窦磊 乔新 杨德琴

重庆医科大学附属口腔医院牙体牙髓科 口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室 重庆401147

牙髓间充质细胞（dental pulp stromal cells，DPSCs）是一种从牙髓组织中分离获得的常用的牙源性间充质细胞，已应用在多种组织修复和再生研究中。DPSCs来源于神经嵴，具有自我更新和多向分化的高增殖潜力[1]。外泌体（exosomes）为细胞通过溶酶体微粒内陷形成的小囊泡，内含丰富的活性物质，如蛋白质、脂质、mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）等，可在细胞间的信息交流与物质交换方面发挥作用[2]。研究[3-4]发现：牙髓间充质细胞外泌体（dental pulp stromal cell-exosomes，DPSC-Exo）具有多种治疗作用，在再生医学领域也有一些应用报道。微环境对外泌体的分泌有明显影响，通过调节细胞生长环境可能起到优化细胞外泌体成分的作用，从而改变外泌体的治疗潜能。

细胞在体内呈三维（three-dimension，3D）立体状态生长，细胞与细胞及胞外基质之间呈相互作用的状态，而目前多数实验研究均采用传统的二维（two-dimension，2D）单层细胞培养模式，即细胞在平面单层生长，并且只会沿着平面延伸，不能很好地复制细胞的体内微环境，对细胞生物学功能、基因表达、胞外囊泡分泌和分化能力都有影响。在此基础上，学者们[5]尝试在3D条件下培养间充质干细胞，主要方式是将细胞植入到具有3D结构的载体中培养，使细胞能够在3D立体空间结构中生长、增殖、迁移及分化，发现其干性、增殖及分化潜能与2D培养的细胞相比存在一些差异，3D培养可放大间充质细胞的旁分泌效应。外泌体作为细胞旁分泌的重要产物，其分泌及所含miRNA会随着细胞自身状态及培养环境的不同而变化[6]。研究[7]发现：DPSCs微球较常规2D培养具有更强的多向分化能力，经转录组测序（RNA sequencing，RNA-Seq）技术检测，前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2，PTGS2）、双调蛋白（amphiregulin，AREG）、上皮调节蛋白（epiregulin，EREG）等与血管再生，细胞迁移、分化、增殖相关基因的表达也显著增高。本课题组在前期研究[8]中也分析了3D培养条件下人DPSCs的基因表达和蛋白组学，推测3D培养也可能会调节DPSC-Exo的miRNA成分，提高DPSC-Exo的治疗潜能。

本研究拟对3D培养模式下的DPSC-Exo miRNA进行表达谱分析，并与2D培养模式下的DPSCExo miRNA进行比较，结合生物信息学技术，探索2种培养条件下DPSC-Exo miRNA的表达差异，并对部分差异miRNA进行靶基因预测，评估3D培养调节外泌体的治疗应用潜能。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

α-MEM细胞培养基（Hyclone公司，美国）；培养皿、孔板（Corning公司，美国）；0.22μm注射式过滤器、超滤管（Millipore公司，美国）；低熔点琼脂糖（Sigma公司，美国）；exoEasy Maxi Kit试剂盒（Qiagen公司，德国）；BCA试剂盒、增强化学发光试剂、RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；兔抗人CD63、CD9抗体（南京巴傲得生物科技有限公司）；Goat Anti-rabbit IgG/HRP抗体（ThermoFisher公司，美国）；显影仪（Bio-Rad公司，美国）；倒置显微镜（Nikon公司，日本）；透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）（Hitachi公司，日本）；纳米颗粒追踪分析仪（ZetaView公司，德国）。

1.2 细胞培养及无血清上清收集

1.2.1 DPSCs的2D培养与上清液收集 经患者及家属知情同意后，收集重庆医科大学附属口腔医院颌面外科门诊因正畸拔除的健康前磨牙。本项目伦理方案经重庆医科大学附属口腔医院伦理委员会批准，批准号为CQHS-REC-2020（LSNo.68）。从釉牙骨质界将牙齿截断，在超净台里取出牙髓，改良酶消化法分离培养DPSCs，取第3代细胞接种到培养皿，当细胞融合率达到80%左右时，换不含血清的α-MEM培养基培养24 h，收集上清液，离心去除沉淀，0.22μm注射式过滤器过滤后置于-80℃保存。

1.2.2 DPSCs的3D培养与上清液收集 取同一个体第3代生长状态良好的DPSCs，以密度为每毫升6×106个细胞的悬液与1.5%低熔点琼脂糖按体积比1∶1混合，接种至12孔板（每孔5×105个细胞）。静置30 min待其结胶后，加入含10%胎牛血清的α-MEM培养基1 mL，3 d后换不含血清的α-MEM培养基培养24h，收集上清液，过滤后置于-80℃保存。

1.3 DPSC-Exo提取

采用exoEasy Maxi Kit试剂盒提取外泌体。将收集的上清液4℃条件下解冻，使用超滤管浓缩，按试剂盒说明书要求，依次加XBP（XBPbinding buffer）和XWP（XWPwash buffer），离心后弃滤液，最后加XE（XE elution buffer）洗脱重悬，即为外泌体溶液。

1.4 DPSC-Exo鉴定

1.4.1 TEM观察DPSC-Exo形态 取新鲜提取的2D和3D培养条件下DPSC-Exo悬液20μL滴于铜网上，10 min后加10μL 2%的醋酸双氧铀于铜网上作用1 min，清洗，室温干燥，样品上机，TEM镜下观察拍照。

1.4.2 蛋白免疫印迹法检测2D及3D条件下DPSCExo标记蛋白CD63、CD9 以体积比外泌体∶RIPA裂解液为2∶1的比例提取外泌体蛋白，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，5×蛋白上样缓冲液混匀后变性10 min，凝胶电泳，转膜，根据说明书稀释兔抗人CD63、CD9抗体，4℃孵育过夜，室温下孵二抗1 h。洗膜后加入增强化学发光试剂显影。

1.4.3 纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA） 取新鲜提取的2D及3D培养条件下的DPSC-Exo 50μL准备检测：1）以去离子水清洗样本池，2）仪器以聚苯乙烯微球（110 nm）校准，3）以1×PBS buffer（Biological Industries公司，以色列）清洗样本池，4）样本以1×PBSbuffer稀释后进样检测。每个样本重复检测3次，该检测由重庆荣达生物技术有限公司合作完成。

1.5 DPSC-Exo miRNA高通量测序

本实验中的DPSC-Exo miRNA高通量测序由武汉华大医学检验所有限公司合作完成，使用BGISEQ-500进行样本测序。采用BCA法进行外泌体蛋白浓度校正，然后进行文库构建。文库构建具体流程为：1）总RNA分离，连接5’端和3’端；2）去接头后cDNA合成；3）cDNA扩增，分离目的片段；4）文库定量及混合后pooling环化；5）质量检测，上机测序。通过对测序所得原始数据去接头、去低质量、去污染等得到可信的备用分析的目标序列，对其进行统计分析。

1.6 生物信息学分析

应用华大基因旗下的Dr.Tom平台对miRNA表达谱进行统计学分析，对差异倍数取对数，设置当︱log2(3D/2D)︱≥1并Qvalue≤0.001时视为显著差异miRNA。选择基因本体论（gene ontology，GO）功能富集分析生物过程、细胞组分和分子功能，选择京都基因和基因组数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）对差异miRNA进行通路富集分析，根据TargetScan靶基因预测数据库对部分miRNA进行再生修复相关的靶基因进行预测。

2 结果

2.1 DPSCs的培养及外泌体的提取鉴定

2D培养条件下，DPSCs贴壁生长，呈长梭状的成纤维细胞样结构（图1A）；3D培养条件下，DPSCs细胞呈球形，分布于胶内（图1B）。通过柱膜法成功从培养上清中分离出外泌体，TEM检测结果显示：2D与3D培养DPSC-Exo均呈典型的茶托状双层膜结构（图1C、D）。蛋白免疫印迹法检测显示：2D-DPSC-Exo与3D-DPSC-Exo均表达CD63、CD9膜蛋白标记物（图1E、F）。NTA检测结果显示：2D及3D组外泌体粒径值为30～150 nm（图1G、H），符合外泌体特征。

图1 2D及3D培养条件下DPSCs与Exo的培养鉴定Fig 1 Culture and identifite of DPSCs and Exo under 2D and 3D culture conditions

2.2 DPSC-Exo miRNA高通量测序结果

2.2.1 miRNA差异表达 共检测出253个miRNA，其中3D组检测出222个，表达量前5位的miRNA分别为hsa-miR-34a-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-302b-3p和hsa-miR-100-5p；2D组检测出154个，表达量最高的为let-7家族及hsa-miR-34a-5p；两组共同表达的123个，3D-DPSC-Exo特有表达的99个（图2A），其中显著差异表达miRNA 60个，与2D组相比，3D组表达上调27个，下调33个[(︱log2(3D/2D)︱≥1，Qvalue≤0.001]（图2B）。上调基因中，hsa-miR-302a/b/c/d-3p家族均显著增高，差异倍数（log）分别为5.23、3.04、4.27、4.74倍；同时，hsa-miR-24-3p（5.37倍）、hsamiR-27b-3p（1.44倍）、hsa-miR-34a-5p（1.38倍）、hsa-miR-100-5p（1.23倍）等均为本底表达量较高且在3D培养条件下表达量显著增高的miRNA（表1）；下调基因中，本底表达量均较低，且变化不大。表达量聚类热图见图3。

图2 差异miRNA表达Fig 2 Differential miRNA expression

图3 2D-DPSC-Exo和3D-DPSC-Exo显著差异表达miRNA聚类热图Fig 3 Significantly differentially expressed miRNAs in 2D DPSC-Exo and 3D DPSC-Exo

表1 部分上调差异miRNATab 1 Partial up-regulated miRNA

2.2.2 靶基因预测 根据TargetScan靶基因预测数据库，对差异倍数最大的2个miRNA进行再生修复有关的靶基因预测：hsa-miR-302的候选靶基因有成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactor，FGF）19和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）等；hsa-miR-24-3p的候选靶基因包括神经再生相关和血管再生、细胞迁移生长等相关，其中神经再生相关的基因包括神经元分化因子（neuronal differentiation，NEUROD）2、神经上皮细胞转化因子（neuroepithelial cell transforming，NET）1、NEUROD1、神经元再生相关蛋白（neuronal regeneration-related protein，NREP），而血管再生和细胞迁移生长等相关的基因包括FGF11、FGF结 合 蛋 白（FGF binding protein，FGFBP）3、FGF受体（FGF receptor，FGFR）3、血小板衍生生长因子受体β多肽（platelet-derived growth factor receptor beta polypeptide，PDGFRB）、血小板衍生生长因子受体α多肽（platelet-derived growth factor receptor alpha polypeptide，PDGFRA）、血管生成素（angiopoietin，ANGPT）4、胰岛素样生长因子结合蛋白（insulin-like growth factor binding protein，IGFBP）5等，部分靶基因见表2。

表2 TargetScan网站预测hsa-miR-302a/b/c/d-3p与hsa-miR-24-3p部分靶基因Tab 2 TargetScan website predicts partial target gene of hsa-miR-302a/b/c/d-3p and hsa-miR-24-3p

2.2.3 GO分析 GO分析结果显示：差异miRNA靶基因主要参与的生物学过程包括细胞过程（cellular process）、生物调节（biological regulation）等，主要涉及的分子功能为结合（binding），且这些差异基因大多为细胞成分（cell part）（图4），分别在RNA聚合酶Ⅱ对转录的调控（regulation of transcription by RNA polymeraseⅡ）、蛋白结合（protein binding）、膜（membrane）等方面出现显著性GO富集（图5）。

图4 2D-DPSC-Exo与3D-DPSC-Exo显著差异表达miRNA靶基因的GO注释分类Fig 4 GO annotation classification of target genesof differential miRNA in 2D and 3D-DPSC-Exo

图5 2D-DPSC-Exo与3D-DPSC-Exo显著差异表达miRNA靶基因分别在生物学过程、细胞组分和分子功能的GO富集情况（Qvalue≤0.05）Fig 5 GOterm histogram of enrichment of target genesof differential miRNAin biological process,cell component and molecular function of 2D-DPSC-Exo and 3D-DPSC-Exo(Qvalue≤0.05)

2.2.4 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析的前20条通路见图6：代谢通路（metabolic pathways）的富集程度最高，所含靶基因数目最多，为1 610个；其次为癌症相关通路（pathways in cancer），含靶基因632个；此外，在Hippo信号通路（Hippo signaling pathway）、自噬（autophagy）等通路上也存在显著富集。

图6 2D-DPSC-Exo与3D-DPSC-Exo显著差异表达miRNA靶基因KEGG通路分析（Qvalue≤0.05）Fig 6 KEGGenrichment pathway of target genesof differential miRNA in 2D-DPSC-Exo and 3D-DPSC-Exo(Qvalue≤0.05)

3 讨论

外泌体作为细胞分泌囊泡中的一类功能成分，避免了直接应用细胞的弊端，具有较高的研究和临床转换价值。牙源性干细胞外泌体已被证明在多种疾病治疗中存在作用，如新型的仿生盖髓术[9]、创伤后的脑损伤功能恢复[10]等，但绝大多数研究都是应用2D培养的细胞外泌体。本研究获得了3D-DPSC-Exo miRNA表达谱，证明其与2D培养存在一些差异，为优化DPSC-Exo生物功效提供了依据，也是一次重要尝试。本研究共检测出253个miRNA，3D组222个，2D组154个，其中60个存在显著差异，对其中部分通路相关的差异miRNA进行初步探讨，并进行生物学分析和组织再生修复相关靶基因预测。

miR-302a/b/c/d家族能够通过双调控细胞周期和凋亡途径来调控人胚胎干细胞的自我更新，是一类在干细胞发育、增殖、分化等方面都有显著作用的miRNA[11-12]。本研究发现miR-302a/b/c/d在3D培养下表达量均显著增高，可靶向FGF19与EGFR的表达，发挥组织再生与修复功能。FGF19与脂质、葡萄糖等多种代谢途径相关，而人体中表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）与肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TGF-α）是EGFR最重要的两种配体，发挥着细胞增殖、血管生成、抑制凋亡等生理功能[13]。miR-302家族在肿瘤疾病中也具有重要的调控作用。有研究[14]报道：外泌体来源的miR-302b可通过转化生长因子βⅡ型受体（transforming growth factor beta typeⅡreceptor，TGFβRⅡ）/细胞外蛋白调节信号激酶（extra cellular signal-regulated protein kinase，ERK）途径抑制肺癌细胞的增殖和迁移，为人类肺癌治疗提供了潜在靶点。综上所述，miR-302家族具有干细胞特性及肿瘤抑制因子特性，3D培养可优化DPSC-Exo miR-302a/b/c/d表达。

miR-24-3p作为一个表观遗传调控因子，在血管内皮细胞的增殖、凋亡、炎症反应等方面均可发挥调节作用[15]，是被广泛深入研究的miRNA之一。靶基因预测显示，hsa-miR-24-3p可靶向多个mRNA发挥组织再生功能，如与神经再生相关的NEUROD2、NET1、NEUROD1和NREP，与血管再生和细胞迁移生长等相关的FGF11、FGFBP3、FGFR3、PDGFRB、PDGFRA、ANGPT4、IGFBP5等。本研究中，3D培养DPSC-Exo表达量显著增加，表明3D培养模式可有效提高miR-24-3p的表达，为其在再生修复相关领域的深入研究奠定基础。

KEGG通路富集分析显示：2D与3D条件下DPSC-Exo差异miRNA的靶基因富集于多个通路，具有一定的研究前景。最显著的是代谢通路（metabolic pathways），所含靶基因数目最多，该通路在次生代谢物的生物合成和嘌呤代谢通路上也存在富集作用，这可能与细胞在2D与3D培养条件下不同的生长环境有关。3D条件下，细胞成球形生长，增殖缓慢，部分miRNA表达显著增高，如上述的miR-302和miR-24-3p等；同时，显著差异表达的miRNA靶基因在癌症通路也存在富集作用，如miR-27b-3p与多种肿瘤的发生发展有关[16-17]；差异miRNA在Hippo信号通路、自噬等通路上同样存在富集。Hippo信号通路在器官大小、癌症发生、组织再生等功能上均有重要作用[18]；而自噬是一种细胞保护机制，也是近年来的研究热点之一。miR-34a-5p与miR-100-5p在2D及3D中表达量均较高，多项研究[19-20]已证明它们在炎症抑制方面具有显著作用，且与自噬相关。miR-34a-5p与miR-100-5p在一些炎症疾病的治疗中可能发挥一定的作用。

近年来，随着组织工程技术的兴起，多项研究[21-23]表明3D培养比2D培养更适合用于多种领域，包括组织再生及癌症生物学。如3D培养Hertwig上皮 性 根 鞘 细 胞（Hertwig’s epithelial root sheath，HERS）促进了细胞的扩张率，产生了更多的矿化组织并促进了牙本质样组织的形成，这可能会开创牙齿相关组织再生领域的新时代[21]；过表达血小板源性生长因子BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB）并包裹在热敏水凝胶中的人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）可以更好地发挥治疗牙槽骨缺损的作用[22]。而通过3D培养技术，成功发现MG53（mitsugumin-53）可通过调节磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinaseB，AKT）信号通路抑制舌癌细胞的发展[23]。随着3D培养技术及外泌体应用领域的发展，二者结合将有更广阔的运用前景。

综上，本研究利用高通量测序技术结合生物信息学分析，对2D-DPSC-Exo及3D-DPSC-Exo miRNA表达谱进行了分析，结果发现：3D-DPSCExo中部分miRNA表达量显著升高，差异miRNA主要富集在代谢、肿瘤、Hippo与自噬等相关通路，可能靶向多种mRNA从而起到促进组织修复再生的治疗作用。3D培养条件下DPSC-Exo可能更具有潜在的应用价值，在今后采用DPSC-Exo进行组织再生修复、肿瘤、发育代谢等研究时，不妨提取3D生长条件下的细胞外泌体。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。