淫羊藿苷对去势自发性高血压大鼠平均动脉压、心率、血清NO及ET-1的影响

于 淼，郭蓉娟，刘 欣，李秀珍，赵超群，李青穆，陈 梦，孟 园，袁 晶，李赛赛

高血压是心脑血管病的独立危险因素，且持续性的高血压能够引发心、脑、肾等靶器官的损伤甚至衰竭。因此，高血压的产生机制及其防治一直是心血管领域研究的重点与热点。高血压的发病机制主要有：遗传、交感神经系统[如肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)]激活、内皮功能紊乱、毛细血管血流受损及炎症介质介导等学说[1-2]。其中内皮功能紊乱较复杂，主要由于内皮源性舒张因子(EDRFs)与内皮源性收缩因子(EDCFs)二者平衡失调所致[3]。其中，舒张因子一氧化氮(NO)与收缩因子内皮素-1(ET-1)常作为内皮功能的检测指标。

雌激素能够降低血压，且对内皮功能有保护作用[4-8]。雌激素替代疗法中，雌激素被用作女性围绝经期及绝经后高血压的临床治疗药物，但尚存在一定争议。中医对于衰老性疾病的治疗有其优势，二仙汤(主要组分为仙茅、仙灵脾，又称淫羊藿)治疗女性围绝经期及绝经后高血压临床疗效明显。淫羊藿苷作为淫羊藿的有效成分，属于异戊烯类黄酮类化合物，结构与雌激素类似，属于植物类雌激素，通过抑制心室重构、减少心肌肥厚等机制产生降压作用[9-10]。本研究观察淫羊藿苷对去势雌性大鼠血压、心率及血清NO、ET-1水平的影响，探讨淫羊藿苷的降压机制及其类雌激素作用，为植物类雌激素及中医补肾法治疗临床心血管疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 9周龄清洁级雌性自发性高血压大鼠(SHR)36只，体质量(150±10)g。9周龄清洁级具有相同遗传背景的正常血压雌性京都Wistar大鼠(空白组)6只，体质量(150±10)g，以上动物均购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证编号：SCXK(京)2016-0006]。普通饲料喂养，室温(22±2)℃，相对湿度(55±5)%，光照时间07：00～19：00。

1.2 实验药物 戊酸雌二醇片(补佳乐)，德国拜耳医药保健有限公司生产，批号：200A5；雌激素受体拮抗剂，氟维司群注射液(芙仕得)，国药集团医药控股北京华鸿有限公司生产，批号：LK774；淫羊藿苷，98%纯度标准品，南京广润生物制品有限公司生产，批号：GR-133-150509。

1.3 实验仪器 大鼠尾套管法无创血压计(日本Softron公司生产，型号：BP-2006A)，酶标仪(美国Thermo公司生产，型号：B004)。

1.4 实验试剂 一氧化氮酶法(比色法)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号：A012-1-2)，ET-1酶联免疫吸附测定(ELISA)测试盒(南京建成生物工程研究所，货号：H093)，磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)兔来源单克隆抗体(美国CST公司，货号：4060S)，蛋白激酶B(Akt)兔来源单克隆抗体(美国CST公司，货号：4685S)。

1.5 实验造模 6只京都Wistar雌性大鼠、36只雌性SHR给予普通饲料适应性喂养1周，继而行无菌卵巢切除术。1 mL/100 g 4%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹位固定，于躯干下1/3、脊柱两侧各1 cm处沿脊柱方向作纵形切口，长约1 cm，逐层分离，深入体腔，可见肉色卵巢团块，用眼科镊轻轻将其拉出，下方连接直径约0.1 cm的肉色输卵管，在输卵管近卵巢端穿一丝线，结扎，剪去卵巢及余线，将组织回纳入腹腔，缝合切口，给予切口青链霉素预防感染。

1.6 实验分组 术后14 d，6只京都Wistar去势雌性大鼠作为空白组，36只去势雌性SHR大鼠随机分为模型组、雌激素组、淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷中剂量组、淫羊藿苷高剂量组及淫羊藿苷中剂量+氟维司群组，每组6只。预实验表明淫羊藿苷中剂量组每天20 mg/kg保护效应最明显，因此，设置淫羊藿苷中剂量组+雌激素受体拮抗剂。空白组、模型组给予溶剂纯水灌胃，雌激素组开始给予戊酸雌二醇(每天0.1 mg/kg)灌胃，淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷中剂量组、淫羊藿苷高剂量组分别给予每天10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg的淫羊藿苷灌胃，淫羊藿苷中剂量+氟维司群组除给予淫羊藿苷每天20 mg/kg，皮下注射氟维司群注射液，每月52 mg/kg。

1.7 标本采集 ①血样标本采集：于给药8周后，用7%水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠腹主动脉取血，放入红色促凝采血管，3 000 r/min离心15 min分离血清，检测血清NO及ET-1水平。②蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测标本，剥离整根主动脉放入液氮中，后转移至-80 ℃冰箱保存，检测p-Akt蛋白及Akt总蛋白表达。

1.8 检测指标

1.8.1 血压及心率 药物干预8周后测量各组大鼠平均动脉压(MAP)及心率。测量方法：用动物无创血压计BP-2006A，将套管套在大鼠尾部，加热鼠笼，使大鼠在温暖的环境中逐渐平静，待情绪稳定后测量大鼠静息状态下的血压及心率。

1.8.2 血清NO及ET-1水平检测 硝酸还原酶法检测各组大鼠血清NO水平，ELISA法检测各组大鼠血清ET-1水平，操作按试剂盒说明书步骤进行。

1.8.3 主动脉Akt通路相关蛋白含量检测 截取主动脉，用于主动脉p-Akt蛋白及Akt总蛋白表达的Western Blot检测。

2 结 果

2.1 各组MAP、心率比较 与空白组比较，模型组MAP明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，雌激素组、淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷中剂量组及淫羊藿苷高剂量组MAP明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与淫羊藿苷中剂量组比较，淫羊藿苷中剂量+氟维司群组MAP明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。模型组心率与空白组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷中剂量组及淫羊藿苷高剂量组心率明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与淫羊藿苷中剂量组比较，淫羊藿苷中剂量+氟维司群组心率明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表1。

表1 各组MAP、心率比较 ()

2.2 各组血清NO、ET-1水平比较 与空白组比较，模型组血清NO水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，雌激素组、淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷中剂量组及淫羊藿苷高剂量组血清NO水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与雌激素组比较，淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷中剂量组NO水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与淫羊藿苷中剂量组比较，淫羊藿苷中剂量+氟维司群组NO水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较，模型组血清ET-1水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，雌激素组、淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷中剂量组及淫羊藿苷高剂量组血清ET-1水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与淫羊藿苷中剂量组比较，淫羊藿苷中剂量+氟维司群组ET-1水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组血清NO、ET-1水平比较 ()

2.3 各组p-Akt/Akt相对表达量比较 与空白组比较，模型组p-Akt/Akt相对表达量明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，雌激素组、淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷中剂量组及淫羊藿苷高剂量组p-Akt/Akt相对表达量明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与淫羊藿苷中剂量组比较，淫羊藿苷中剂量+氟维司群组p-Akt/Akt相对表达量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组p-Akt/Akt相对表达量比较 ()

3 讨 论

本研究给予大鼠卵巢切除术，模拟围绝经期及绝经后期低雌激素水平状态。与具有相同遗传背景的空白组比较，雌性SHR血压明显升高。既往研究证实，淫羊藿苷能通过改善肾损伤、减少心室重构及心肌细胞凋亡，从而改善高血压靶器官损害，但尚缺乏淫羊藿苷对血压作用的报道[9，11-12]。本研究表明，淫羊藿苷能降低去势雌性SHR血压，该作用与雌激素类似，且能够被雌激素受体拮抗剂阻断。

既往研究表明，京都Wistar雌性大鼠心率比雌性SHR快[13]。但本研究发现，去势雌性京都Wistar大鼠与去势雌性SHR心率无明显差异。因此，雌激素水平的高低是否是导致这一差异的原因，尚需进一步研究。关于雌激素对SHR心率影响的国内外研究较少，本研究发现：外源性雌激素补充能降低雌性SHR的血压，且淫羊藿苷与雌激素在对心率的影响方面相似，淫羊藿的该作用能被雌激素受体拮抗剂削弱。

NO是一种内皮源性舒张因子，具有较强的舒张血管的作用，其作用机制为NO激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，后者将三磷酸鸟苷(GTP)转化为环磷鸟苷(cGMP)，从而激活蛋白激酶G导致细胞内钙浓度下降；另一方面，NO 能够激活内质网钙三磷酸腺苷(ATP)酶，从而降低细胞内钙浓度。此外，NO还能够降低炎性因子及组织因子的释放、抑制血管细胞增殖、减少血小板黏附。ET-1是迄今所知缩血管最强的物质，主要通过与血管平滑肌细胞上ET-A型受体结合，激活L-型钙通道，使Ca2+内流，细胞内Ca2+浓度增加，与肌钙蛋白结合引起收缩。ET-1还能影响炎症反应、细胞生长、胚胎发育、肾功能、心血管稳态、内分泌功能、呼吸功能、生殖系统等。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是NO及ET-1共同的上游信号途径，也是雌激素膜受体的下游信号通路[14]。既往研究表明，与京都Wistar大鼠比较，SHR血清NO水平明显降低，而ET-1水平明显升高；雌激素能够通过下调PI3K/Akt通路蛋白表达，升高血清 NO，降低血清ET-1水平，起到对心血管系统的保护作用[15-19]。本研究表明，淫羊藿苷与雌激素相似，能够升高血清NO水平而降低ET-1水平，从而调节内皮功能，该作用是通过下调Akt蛋白磷酸化表达实现的，且可被雌激素受体拮抗剂所阻断。因此，淫羊藿苷的降血压作用与其调节NO及ET-1的分泌量及功能有关。

综上所述，淫羊藿苷作为植物类雌激素，能够通过改善内皮功能而发挥降压作用。其作用温和，具有临床药用价值。本研究为二仙汤及补肾法在围绝经期及绝经后女性高血压的临床治疗提供了理论基础，也为植物类雌激素在围绝经期及绝经后女性心血管疾病的临床预防及治疗应用方面提供了理论基础。