系统性红斑狼疮ABCG1和GALNT2基因启动子区甲基化的临床意义

曹程 王庆凯 杨宝刚 马明静

(河北省沧州中西医结合医院心内科，河北 沧州061001)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是好发于育龄期女性的自身免疫性弥漫性结缔组织疾病，患者体内产生过量攻击自身抗体，引起体内多器官、组织损伤，有效控制SLE病情可明显延长患者生存时间[1-2]。SLE临床症状具有多样化特点，并且其临床症状随着SLE病情变化呈轻重交替出现现象，可出现全身性炎症、皮肤黏膜、肌肉关节、肾脏和血液系统等疾病症状，还可引起胸腔积液、肺间质纤维化或肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)[3]。PH是由多种因素所致肺动脉压异常升高疾病，也是SLE常见并发症，系统性红斑狼疮合并肺动脉高压(systemic lupus erythematosus and pulmonary hypertension，SLE-PH)具有疾病进展迅速，控制难度和致死率均高的特点[4-5]。因此，尽早采取积极有效的防控措施对改善SLE患者预后具有重要意义。DNA甲基化属于DNA化学修饰形式之一，可在不改变DNA序列情况下改变遗传表现。人类基因启动子区域含有大量DNA甲基化修饰位点，某些基因启动子区异常甲基化可诱导肿瘤、自身免疫性疾病和心脑血管疾病等发生[6-8]。现探讨ABCG1和GALNT2基因启动子区甲基化与SLE相关PH预后关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月—2017年1月河北省沧州中西医结合医院收治的SLE患者123例，纳入标准：(1)纳入患者均符合中华医学会风湿病学分会制定的《系统性红斑狼疮诊断及治疗指南》中的诊断标准；(2)年龄>20岁。排除标准：(1)合并先天性心脏病、原发性心肌病；(2)肺癌、肺栓塞、肺静脉闭塞、慢性阻塞性肺部疾病和门静脉高压患者；(3)合并恶性肿瘤；(4)合并严重肝肾功能障碍；(5)重叠综合征；(6)认知功能障碍；(7)妊娠期、哺乳期妇女。纳入患者对本研究均知情，自愿签署知情同意书，通过本医院伦理委员会批准。

1.2 分组方法

PH的诊断参照欧洲心脏病学会(ESC)制定的《肺动脉高压诊断和治疗指南》中的诊断标准[9][右心导管测量显示肺动脉平均压≥25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)]将123例患者分为合并PH组(SLE-PH组，n=48)与不合并PH组(SLE-noPH组，n=75)。

1.3 检测指标

1.3.1 基本资料

根据患者的临床资料，统计分析患者性别、年龄、右心室内径、右心房上下径、右心房左右径、左心室内径、肺动脉宽度、射血分数、美国纽约心脏病协会(NYHA)分级、SLE疾病活动度指数(SLE disease activity index，SLEDAI)和伴随疾病等情况。

1.3.2 ABCG1和GALNT2基因启动子区甲基化检测

患者入院后，采集清晨空腹静脉血4 mL，置于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中，采用全血基因组DNA提取试剂盒(美国Promega公司)提取DNA，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

亚硫酸氢盐修饰基因组DNA以及DNA纯化回收：向聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)管中加入15 μL DNA Protect Buffer、85 μL Buffer mix和40 μL DNA样本，混匀，于PCR仪(95 ℃ 5 min，60 ℃ 25 min，95 ℃ 5 min，60 ℃ 85 min，95 ℃ 5 min，60 ℃ 175 min，20 ℃ 2 min)进行重亚硫酸氢盐转化；转化完成后向样本中加入310 μL Buffer BL、250 μL无水乙醇脉冲混匀15 s，12 000 r/min离心1 min，加入500 μL Buffer BW，12 000 r/min离心1 min，弃滤液。加入500 μL Buffer BD，室温静置15 min，12 000 r/min离心1 min，弃滤液。加入500 μL Buffer BW，12 000 r/min离心1 min(重复2次)。加入250 μL无水乙醇，12 000 r/min离心1 min，室温挥发5 min，加入39 μL Buffer EB溶液洗脱离心柱中的DNA，将所得DNA用于甲基化特异性PCR检测与琼脂糖凝胶电泳判定甲基化结果。

根据人类基因数据库核实ABCG1和GALNT2基因启动子区以及上游序列，采用Primer Express Software v2.0(ABI公司)软件设计ABCG1和GALNT2基因启动子区甲基化、非甲基化特异性PCR引物(引物由华大基因科技有限公司合成)，ABCG1甲基化：sense 5’-ATTTGTATTGTGATATCGACGAGAC-3’，antisense 5’-CTTACCTCCTCGATTCTAAACGTAC-3’，退火温度54 ℃； ABCG1非甲基化：sense 5’-AGATTTGTATTGTGATATTGATGAGAT-3’，antisense 5’-AACTTACCTCTCAATTCTAACATAC-3’，退火温度48 ℃； GALNT2甲基化：sense 5’-TTATAAGATAGATCTTTTTTTGTATC-3’，antisense 5’-CCGCTAATATGATTTTATTAT-3’，退火温度48 ℃； GALNT2非甲基化：sense 5’-ATGTTATAAGATAGATTTTTTTTTTATT-3’，antisense 5’-AACCCACTAATATCAATTTTATTAT-3’，退火温度46 ℃。甲基化特异性PCR体系：5 μL PCR Buffer，0.5 μL dNTP mix，0.5 μL sense引物，0.5 μL antisense引物，0.5 μL DNA模板，0.1 μL KAPA Taq DNA聚合酶，17.90 μL无菌水。PCR循环参数设置为95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，68 ℃ 5 min，72 ℃ 1 min，10个循环；95 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，39个循环，72 ℃延伸6 min。收集甲基化特异性PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统中的Quantity One软件对目标条带进行分析，观察ABCG1和GALNT2基因启动子区甲基化情况。

1.3.3 不良预后

纳入患者从入院治疗日开始计算，跟踪随访3年，记录患者3年存活情况，以死亡作为患者不良预后判定标准。

1.4 统计分析

2 结果

2.1 两组患者基本资料比较

两组患者年龄、性别、病程、射血分数和关节炎、口腔溃疡、发热、光敏感、肺间质病变构成比比较，均无统计学差异(P>0.05)；SLE-PH组雷诺现象、活动后胸闷、指端血管炎构成比和右心室内径、右心房上下径、右心房左右径、肺动脉宽度、SLEDAI、ABCG1甲基化比率、GALNT2甲基化比率均显著高于SLE-noPH组(P<0.05)，而左心室内径和NYHA分级(Ⅰ～Ⅱ)构成比显著低于SLE-noPH组(P<0.05)，见表1。

表1 两组患者基本资料比较

2.2 ABCG1和GALNT2基因启动子区甲基化对SLE患者生存的影响

ABCG1启动子区甲基化组平均生存时间为(30.53±1.08)个月，ABCG1启动子区非甲基化组平均生存时间为(33.75±0.99)个月，Log-Rank检验显示差异有统计学意义(χ2=4.076，P=0.043)，见图1。GALNT2基因启动子区甲基化组平均生存时间为(29.91±1.44)个月，GALNT2基因启动子区非甲基化组平均生存时间为(32.81±0.90)个月，Log-Rank检验显示差异无统计学意义(χ2=2.661，P=0.103)，见图2。

2.3 死亡组和存活组患者基本资料比较

在SLE患者中，死亡组雷诺现象、肺间质病变、ABCG1甲基化构成比率和右心室内径、右心房上下径、右心房左右径、动脉宽度、SLEDAI均显著高于存活组(P<0.05)，而NYHA分级(Ⅰ～Ⅱ)构成比率显著低于存活组(P<0.05)，见表2。

表2 死亡组患者和存活组患者基本资料比较

在SLE-PH患者中，死亡组雷诺现象构成比率和SLEDAI均显著高于存活组(P<0.05)，而NYHA分级(Ⅰ～Ⅱ)构成比率显著低于存活组(P<0.05)，见表2。

2.4 Cox回归分析SLE患者不良预后危险因素

将表2中差异有统计学意义的因素纳入多因素Cox回归分析，使用向前法进行Cox模型多因素分析SLE患者不良预后危险因素，结果显示，NYHA分级(Ⅲ～Ⅳ)、SLEDAI(≥20分)和ABCG1甲基化是SLE患者不良预后的危险因素(P<0.05)，NYHA分级(Ⅲ～Ⅳ)是SLE-PH患者不良预后危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 Cox回归分析SLE患者不良预后危险因素

3 讨论

SLE为多脏器受累的慢性自身免疫性系统疾病，中国SLE患病率为70/100 000，女性患病率为113/100 000[10-11]，SLE发病与遗传、环境等多种因素有关。PH是SLE严重并发症之一，其并发率为0.5%～43.0%[12-13]，肺动脉压力增加和肺血管阻力升高是引起PH患者右心衰竭或死亡的原因之一[14-15]。SLE-PH与肺血管内皮功能障碍、血管重塑、自身抗体形成、免疫功能异常、肺血管炎和血栓形成等因素有关[16]。表观遗传学修饰可通过调控免疫相关基因表达水平参与心血管疾病、神经类疾病和恶性肿瘤等疾病的发生、进展过程。DNA甲基化是表观遗传学修饰方式之一，DNA甲基化可在DNA甲基转移酶作用下将胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸胞嘧啶甲基化为5-甲基胞嘧啶，对基因表达有调节作用。

人类ABCG1位于21号染色体上，含23个外显子，属于跨膜半转运体。ABCG1在脑、肾上腺、巨噬细胞、胸腺和肺部高表达，具有防止脂质过量积累和发挥预防动脉粥样硬化的作用[17]。ABCG1可促进胆固醇从细胞流出，通过提高胆固醇在细胞膜双层间运动，增强与成熟富脂载脂蛋白结合，清除体内多余胆固醇。GALNT2位于1号染色体上，含16个外显子，属于多肽-N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族成员，在O-糖基化反应过程中发挥重要作用。此外，GALNT2还可通过调节脂质代谢糖基化改变体内脂质水平，对调节体内脂质稳定性具有重要意义[18-19]。本研究结果显示SLE-PH患者的SLEDAI、ABCG1甲基化比率和GALNT2甲基化比率显著高于SLE-noPH患者，与研究[20]结果存在相似趋势，出现此现象的原因可能与PH发病机制有关，脂质代谢紊乱可引发体内炎症反应，内皮细胞炎症趋化因子高表达可引起白细胞迁移，增强炎症反应，引起血管内皮细胞功能损伤，增加PH发病风险。

本研究发现SLE-PH患者NYHA分级(Ⅰ～Ⅱ)构成比明显低于SLE-noPH患者，已有研究[21]表明SLE-PH患者3年存活率为44.90%，而5年存活率为16.80%，SLE-PH降低患者存活率可能与PH所致心功能降低有关，SLE-PH可使肺血管炎症内壁增厚，引起管腔变窄，肺循环阻力增大，导致肺部功能降低，从而影响患者预后。SLE早期伴随的肺血管炎属于急性病症，及时给予免疫抑制剂、激素治疗可逆转，但随着SLE疾病加重，肺血管炎则转变为纤维素样坏死，此病变属于PH的慢性病理改变，临床治疗可逆性差，所以SLE-PH患者长期预后情况差。

本研究还发现ABCG1甲基化SLE患者3年平均生存时间明显低于ABCG1非甲基化患者，而GALNT2甲基化与其非甲基化患者3年平均生存时间比较无统计学差异，说明ABCG1甲基化可能会影响SLE患者长期预后情况。此外，本研究发现雷诺现象、肺间质病变、ABCG1甲基化、NYHA分级以及心室内径、心房大小可能对SLE患者不良预后存在影响，进一步Cox分析显示NYHA分级(Ⅲ～Ⅳ)、SLEDAI(≥20分)和ABCG1甲基化是SLE患者不良预后的危险因素。NYHA分级(Ⅲ～Ⅳ)是SLE-PH患者不良预后的危险因素，可能是因为SLE-PH患者体内ABCG1甲基化水平较高，影响对胆固醇、脂质过量积累调节能力，引起血管内壁炎症反应，血管内皮细胞功能降低，加重患者心功能损伤，导致患者预后生存时间减少。因此，SLE-PH患者可选用DNA甲基化转移酶抑制剂治疗以逆转基因的甲基化状态，恢复ABCG1和GALNT2表达，减少血管内皮细胞损伤，增强对胆固醇的调节作用，降低肺动脉压力及不良预后的发生风险，从而延长患者生存时间。

本研究仍存在一定局限性，如纳入患者主要为本地区患者，未纳入经济状况和教育背景等其他人口学因素的影响；纳入样本数量较少，可能会影响研究结果的可靠性；随访时间只随访至3年，可能延长随访时间能得到更多的临床代表性结果。

综上所述，SLE-PH患者ABCG1和GALNT2甲基化构成比较高且ABCG1甲基化可能会影响SLE患者预后，NYHA分级(Ⅲ～Ⅳ)是SLE-PH患者不良预后的危险因素。临床可增加DNA甲基化转移酶抑制剂治疗以逆转ABCG1和GALNT2表达水平，注重患者心功能恢复救治，改善心脏的相应调节功能，以延长患者生存时间。