应用CD83 和HSF5 鉴别生前与死后皮肤烧伤

赵龙瑞，肖静，尚晴，李涛，刘新社，官方霖

西安交通大学医学部法医学院，陕西 西安710061

在法医学实践中，火场发现的尸体常常需要辨别是生前烧死还是死后焚尸，其主要依据是尸体是否存在生活反应。传统法医学鉴定主要基于皮肤红斑和水疱，呼吸道和（或）消化道内的烟灰沉积以及血液中碳氧血红蛋白浓度升高进行判断。但法医病理学实践中发现：在死后焚尸案例中尤其是死亡时间与焚尸时间十分接近时皮肤红斑和水疱也会出现；在开放露天的火场中，呼吸道和消化道烟灰沉积以及血液中碳氧血红蛋白浓度升高的现象可能不会发生，火场中的尸体更需要明确是烧死还是死后焚尸。因此，法医学实践中需要更为科学、精准、高效的方法对生前烧死和死后烧伤进行鉴别。

白细胞分化群83（cluster of differentiation 83，CD83）编码的蛋白质是受体免疫球蛋白家族成员之一，参与抗原呈递、免疫抑制等生命过程[1-2]。热休克转录因子5（heat shock transcription factor 5，HSF5）是转录因子热休克因子家族成员之一，有研究[3]表明，HSF5 在细胞周期、细胞凋亡方面可能有重要作用。

在前期研究[4]中，本课题组建立了小鼠烧伤模型，使用芯片技术检测出24 个差异表达的microRNA（其中19 个上调，5 个下调），并通过京都基因和基因组百科库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG）、基因本体（gene ontology，GO）分析等筛选出293 个上游表达基因，其中CD83 和HSF5 基因表达水平变化较为明显。基于以上研究结果，本研究将CD83 及HSF5 作为目标基因，通过建立小鼠皮肤烧伤模型，检测烧伤皮肤中CD83 及HSF5 的mRNA 变化，并在法医学尸体解剖皮肤检材中验证，以期探索其在法医学实践中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 小鼠皮肤深Ⅱ度烧伤模型制作及检材提取

采用由西安交通大学动物实验管理中心提供的健康雄性BALB/c 小鼠［7～8 周龄，（25±3）g］进行动物实验，分为生前烧伤组、空白对照组和死后烧伤组。

生前烧伤组按照参考文献[4]进行建模：腹腔注射0.3%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉后，使用电动剃毛刀剃除小鼠背部毛发，暴露背部皮肤。使用加热至100 ℃的铜梳（30 mm×10 mm）烧灼小鼠背部皮肤，持续4 s，0.5 h 后腹腔注射过量0.3%戊巴比妥钠（60 mg/kg）处死所有小鼠，室温（24 ℃）保存。通过组织学验证[4]，此过程可造成小鼠背部皮肤深Ⅱ度烧伤。生前烧伤组的小鼠依次在其处死后0、6、12、24、48、72、96、120 h 进行取材（每时间点各3 只）。仔细将小鼠背部皮肤与肌肉进行分离，使用外科剪取烧伤处皮肤5 mm×5 mm，取样后立刻将其置于液氮中保存待检。

空白对照组和死后烧伤组每组各3 只小鼠，采用前述方法麻醉脱毛并处死，空白对照组皮肤样本取自未损伤的小鼠，死后烧伤组样本取自处死小鼠0.5 h后，按照上述方法制造烧伤模型后取小鼠皮肤，取材大小均为5 mm×5 mm。动物实验由西安交通大学医学部伦理委员会批准，所有实验过程均得到西安交通大学医学部伦理委员会审核、批准（审批号20190103）。

1.2 人体皮肤烧伤样本提取

人体皮肤烧伤样本取自死亡原因为重度烧伤或伴一氧化碳（CO）中毒的法医学尸体解剖实际案例，其中男性样本10 例，女性样本5 例，对照组取自相同案例未受损伤处皮肤。利用Agilent RNA 6000 Nano 试剂盒（美国Agilent 公司）结合Agilent 2100 生物分析仪（美国Agilent 公司）检测RNA 完整性指数（RNA integrity number，RIN），详细信息见表1。解剖时仔细将取材部位皮肤和肌肉进行分离，并在烧伤和未烧伤部位皮肤各取5 mm×5 mm，置于装有2.0 mL RNA 稳定保存液（RNAlaterTMstabilization solution，RNAlater）的离心管中，并迅速放入液氮中保存。本研究由西安交通大学医学部伦理委员会批准，所有实验过程均得到西安交通大学医学部伦理委员会审核、批准（审批号20190103）。

表1 案例资料Tab.1 Cases information

1.3 RT-qPCR

使用PrimeScriptTMRT-PCR 试剂盒（日本TaKaRa公司）获得总RNA 的cDNA 拷贝。使用ECOTMReal-Time PCR 系统（美国Illumina 公司）和SYBR®Premix Ex TaqTM（日本TaKaRa 公司）在48 孔反应板上进行RT-qPCR 实验。选用GAPDH作为RT-qPCR 的内参，反应条件：94 ℃ 30 s，1 个循环；95 ℃ 5 s，61 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40 个循环；95 ℃15 s，55 ℃15 s，95 ℃15 s，1 个循环。反应体系：2×Realtime PCR Mix 5.0 μL，内参及目的基因的上下游引物各0.5μL，无菌无酶水3.0μL，cDNA 1.0 μL，总体积为10.0 μL，通过2-ΔΔCt方法确定其相对表达水平。基因特异性引物信息参见表2。

表2 RT-qPCR 特异性引物序列Tab.2 Specific primer sequences for RT-qPCR

1.4 数据分析

所有样本均进行3 次RT-qPCR 实验，数据以均数±标准差（）表示。采用非参数Mann WhitneyU检验进行个体间的比较，通过Spearman’s Rho 检验分别进行RIN 与年龄、性别、死后经过时间（postmortem interval，PMI）等参数的相关性分析。选用Graphpad prism 7.0（美国GraphPad Software 公司）和Stat-View（美国StatView 公司）进行统计分析，检验水准α=0.05。同时计算mRNA 相对含量在组间的差异倍数（fold change，FC），FC 值越大，差异越显著。

2 结果

2.1 小鼠皮肤烧伤样本

与死后烧伤组和空白对照组相比，生前烧伤组（死后0 h）CD83 和HSF5 的mRNA 水平升高（P＜0.05，表3）。CD83 的mRNA 水平升高在死后96 h 仍可明显检出，而HSF5的mRNA 水平升高可以持续至死后72 h（表3）。生前烧伤组（死后0 h）、死后烧伤组和空白对照组RIN 差异无统计学意义（P＞0.05），但随着PMI 的延长，生前烧伤组RIN 逐渐降低（表4）。

表3 不同PMI下CD83 和HSF5 的差异倍数Tab.3 Fold change of CD83 and HSF5 at different PMI（n=3，x¯ ±s）

表4 死后120 h 内RIN 变化Tab.4 RIN changes within PMI 0 h and 120 h（n=3，）

表4 死后120 h 内RIN 变化Tab.4 RIN changes within PMI 0 h and 120 h（n=3，）

2.2 人体皮肤烧伤样本

与人体正常皮肤相比，在15 例（男性10 例，女性5 例）尸体样本中，11 例（男性7 例，女性4 例，59 h≤PMI≤75 h，3.4≤RIN≤5.0）CD83 和HSF5 的mRNA 升高（P＜0.05），4 例（男性3 例，女性1 例，52 h≤PMI≤73 h，3.9≤RIN≤4.9）变化无统计学意义（P＞0.05），见表5。

表5 人体检材中烧伤与未烧伤处皮肤CD83 和HSF5 差异倍数Tab.5 Fold changes of CD83 and HSF5 in human burned and unburned skin samples（n=3，）

表5 人体检材中烧伤与未烧伤处皮肤CD83 和HSF5 差异倍数Tab.5 Fold changes of CD83 and HSF5 in human burned and unburned skin samples（n=3，）

注：1）与未损伤皮肤相比，P＜0.05。

3 讨论

在火场发现尸体时，法医需要谨慎评估死亡原因和死亡方式，即判断是否存在杀人后焚尸以掩盖案件真相的可能。然而，传统的鉴定指标如尸体皮肤红斑、呼吸道烟尘等在法医病理实践过程中可能会存在不明确甚至缺失的情况，这些情况的出现提示寻找准确可靠的生活反应指标的重要性。据报道[5-6]，一些信号转导通路可用于探究生活反应。GAUCHOTTE 等[7]认为，CD15 及类胰蛋白酶是生活反应存在的可靠标志物。目前有关生前烧伤与死后焚尸的生活反应鉴别研究较少，免疫组织化学研究[8-10]表明，生前烧死尸体的呼吸道和肺部中热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）、纤连蛋白（fibronectin，Fn）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）及血小板-内皮细胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）表达水平升高。KUBO 等[11]研究认为，生前烧死尸体皮肤中水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）的mRNA 表达明显增加。然而在实际检案中，相关指标缺乏统一的量化标准，无法进行科学精准的检测，尤其是免疫组织化学法等受取材等因素的影响，显微镜下观察可能会出现漏检错检的情况，进行镜检也较为耗时费力，而针对mRNA 的检测则更为精确高效，但针对烧伤相关基因检测并未形成系统。皮肤是人体最大的器官，覆盖人体表面，在火场中，皮肤作为第一接触热源的组织器官，相对呼吸道、血液等，反应更为灵敏、直接。因此，本研究通过对皮肤烧伤动物模型和人体烧伤样本的研究，以期寻找有实际应用价值的生活反应指标。

对小鼠的研究结果表明，与空白对照组相比，生前烧伤皮肤中CD83 和HSF5 的mRNA 水平明显升高，而死后烧伤组并没有明显变化，提示CD83 及HSF5 伤后反应灵敏。针对尸体随时间推移存在不同程度的死后变化现象，实验通过对不同时间点的RIN 变化进行了观测。RIN 反映RNA 的降解情况，最小值为1，表示RNA 完全降解；最大值为10，表示RNA 完整、未降解[12]。本研究中，RIN 随着时间增加而降低，符合死后mRNA 降解的一般变化。与空白对照组相比，生前烧伤组于死后0 h CD83 和HSF5 表达量明显增加，且随着时间推移，表达量有所降低，但CD83 表达量在死后96 h 仍明显高于空白对照组，HSF5 表达量增加也可以持续至死后72 h。这些结果表明，即使尸体存在腐败、自溶等死后现象，CD83 和HSF5 的mRNA 高表达在一定时间内仍可检测出，有望成为鉴别生前烧伤生活反应指标。为进一步探索CD83 和HSF5 的法医学实际应用价值，检测15 例人体皮肤烧伤样本的mRNA 水平变化，为减少mRNA 降解对本实验的影响，实验测量了所有人体样本的RIN，结果显示所有样本的RIN 均大于3，提示样本mRNA 的完整性较好。在15 例人体样本中，11 例CD83 和HSF5 的mRNA 升高，4 例没有明显变化，该情况是否与个体差异有关还要进一步验证。总体来讲，本研究由于客观条件受限，符合实验要求的烧伤人体样本数量不足，无法对人体样本相同部位mRNA 进行检测，未排除不同人体部位mRNA 表达水平可能不一致的情况，以上问题都可能对结果造成影响。后续研究我们将进一步完善各种不足，深入探究烧伤皮肤中的mRNA 变化，寻找可靠的生活反应指标。

综上所述，本研究通过建立小鼠皮肤烧伤模型以及人体烧伤组织样本验证，探索了CD83 及HSF5 在鉴别生前烧伤和死后焚尸中的实际应用价值，CD83 和HSF5 mRNA 有望作为皮肤烧伤生活反应指标应用于法医学实践。