易被误判为三等位基因的分型结果1 例

孙烈婷，王文婷，陈曼，王芳，刘莹

1.甘肃迪安同享医学检验中心司法鉴定所，甘肃 兰州 730000；2.迪安鉴定科学研究院，浙江 杭州 310000；3.中国科学院北京基因组研究所，北京100000

1 案 例

1.1 简要案情

因亲缘关系鉴定需要，被检父姚某、孩子母亲梁某及孩子要求进行亲子鉴定，采集末梢血，制成血卡，阴干后避光干燥保存。

1.2 检验过程与结果

1.2.1 初次检验

使用MicroreaderTM21 ID 系统（北京阅微基因技术有限公司）复合扩增3 人血样基因座，反应体系和循环参数均按照试剂盒说明书设置。使用3130xl基因分析仪（美国Applied Biosystems 公司）电泳分离扩增产物，GeneMapper®ID-X软件（美国Thermo Fisher Scientific 公司）分析电泳结果，等位基因分型标准物（ladder，北京阅微基因技术有限公司）及血样分型的相关数据见图1。

图1 MicroreaderTM 21 ID 系统检测图谱Fig.1 Genotyping of MicroreaderTM 21 ID System

母亲与孩子在FGA基因座分型分别为“17.2，22，24.2”及“17.2，24，24.2”，出现3 个等位基因，其他基因座未出现明显异常，更换试剂盒进行验证。

1.2.2 复检

采用人类DNA 分型盒（白金）（深圳华大法医科技有限公司）重新扩增母亲与孩子血样（图2）发现，母子FGA基因座分型为“22，24.2”“24，24.2”，均为杂合子，没有MicroreaderTM21 ID 系统检测出的“17.2”等位基因，在vWA基因座却出现三等位基因现象。对照MicroreaderTM21 ID 系统分型结果，母亲及孩子vWA基因座分型在“14，18”及“14，17”以外，均出现了一个off-ladder 峰（以下简称OL 峰），片段长度分别为305.93、305.78 bp，按照片段长度，应标记为14.2。

图2 人类DNA 分型盒（白金）检测图谱Fig.2 Genotyping of Human DNA Typing Kit（Platinum）

比对初次检验与复检结果，推测2 个基因座的三等位基因中的一个来自较目标基因座片段稍短的D2S1338。

1.2.3 测序与结果

将母亲与孩子的样本的D2S1338基因座进行克隆测序，结果显示：母亲与孩子的D2S1338基因座均分别检出18、36 个重复单位，其中等位基因18 包括7 个TGCC 重复和11 个TTCC 重复；母亲的等位基因36 包 括7 个TGCC 重 复、27 个TTCC 重 复 和2 个GTCC重复；孩子的等位基因36 包括7 个TGCC 重复、26 个TTCC 重复、1 个TTAC 重复和2 个GTCC 重复。

1.2.4 鉴定意见

根据母亲参与下累积父权指数（cumulative paternity index，CPI）计算公式[1]，计算得到CPI值为1.70×1010，支持被检父为孩子的生物学父亲。

2 讨论

短串联重复（short tandem repeat，STR）是广泛存在于人类基因组中的一类具有高度多态性的遗传标记，具有分布广泛、多态性高、可复合扩增的优点，是目前全世界法医DNA 实验室运用最广泛的一类遗传标记[2]。一般情况下，人常染色体单个STR 基因座的等位基因分型表现为纯合子或杂合子，纯合子含有两个相同的等位基因（约占10%），杂合子即含有两个不同的等位基因（约占90%）[3]。在极个别情况下，单个STR 分型图谱会出现3 条等位基因，国内外文献[4-6]推测是由于染色体非整倍体、减数分裂期间同源染色体发生错位配对和重组而造成染色体内部分片段重复、嵌合体以及体细胞突变等原因形成。

本案中，MicroreaderTM21 ID 系统检测的FGA基因座分型结果出现三等位基因，用人类DNA 分型盒（白金）验证，该基因座出现正常的杂合分型，而原正常杂合分型的vWA基因座出现了三等位基因，推测两个基因座可能并非真正存在三等位基因。在MicroreaderTM21 ID 系统检测图谱中，出现三等位基因的FGA基因座为红色荧光标记的最大片段基因座，其后无相同荧光标记的基因座，比FGA基因座片段稍短的D2S1338基因座只有1 个等位基因；在人类DNA 分型盒（白金）检测图谱中，vWA基因座出现三等位基因，较vWA片段稍长的Penta E基因座有峰值比较接近的两个等位基因，比vWA基因座片段稍短的D2S1338基因座同样只有1 个等位基因，其余均无异常。可以看出，2 种试剂盒出现三等位基因的基因座均与D2S1338相邻，且该基因座只检出1个等位基因。推测FGA和vWA基因座异常增加的等位基因可能来自D2S1338基因座。根据2 种试剂盒等位基因分型标准物，分别计算异常等位基因，其结果均为36个重复单位。

通过克隆测序检测D2S1338基因座序列，得到准确的等位基因分型，证实了上述结果。在D2S1338基因座等位基因36 中，核心重复序列与《法医物证学》[7]中提到D2S1338基因座核心序列TTCC 及TGCC 不同。本案中，母亲及孩子的D2S1338基因座等位基因36 除了上述2 种核心序列，还出现了GTCC 及TTAC。另外，发现母子核心序列不一致。母亲为7 个TGCC重复、27 个TTCC 重复和2 个GTCC 重复，孩子为7 个TGCC重复、26个TTCC重复、1 个TTAC 重复和2 个GTCC 重复，母子的TTCC 重复数量不同，推测应该是1 个TTCC 核心序列中C 碱基突变为A，导致以上结果。

通过本案例，提示在实际检案工作中对于检测出的三等位基因，必须采用其他试剂盒进行验证，排除扩增及检测过程造成的漂移，甚至如本案这种非常稀有的超长基因等情况，必要时应通过测序确定基因座序列，使鉴定结果更加准确。