外泌体非编码RNA调控骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

谷营营 蔺一凡 郑天霞 董伟

华北理工大学口腔医学院，河北 唐山 063210

骨髓间充质干细胞( bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)起源于中胚层细胞，增殖能力强，分化谱系多[1]，可在不同诱导条件下分化为成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、基质细胞、神经细胞等[2]，具有自我更新、成骨分化及免疫调节等功能[3]。骨再生是一个复杂而高度调控的过程，有膜内骨化和软骨内骨化两种不同的方式，在膜内骨化过程中，由BMSCs成骨分化而来的成骨细胞形成骨[4]，故可以通过调控BMSCs骨向分化促进骨再生[5]。BMSCs的成骨分化功能在骨组织工程中极具应用前景[6]，研究调控其骨向分化的分子机制对骨科领域具有重大意义。

外泌体(exosomes)是一种由细胞内多胞体与胞膜融合后再释放到细胞外环境的纳米级膜性脂质囊泡，富含核酸、蛋白质、胆固醇等多种生物活性物质[7]。研究[8]发现，外泌体源性非编码RNA主要包括微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和环状RNA(circular RNA，circRNA)，可以通过多种作用机制调控BMSCs成骨分化。外泌体通过旁分泌途径表达生物学效应[9]，运输生物活性物质调控细胞间通讯[10]，无信息传递屏障等特殊的生物学特性，在介导非编码RNA调控BMSCs成骨分化过程中极大的提高了信息传递效率[11]，使其在骨质疏松症等骨代谢类疾病诊断及治疗方面更具临床优势，本文就此研究进展做一综述。

1 外泌体miRNA对BMSCs成骨分化作用机制

MiRNA是一类长度大约18～24个核苷酸的非编码单链RNA分子，通过与目标RNA结合，参与调控翻译后的基因沉默，抑制相关基因表达[12]。早在2014年，Xu等[13]对BMSCs来源的外泌体miRNAs在调控BMSCs成骨分化过程中的表达谱分析中发现，9种miRNAs(miR-203、miR-218、miR-219、let-7a、miR-148a、miR-135b、miR-199b、miR-302b和miR-299-5p)被上调促进成骨分化；5种miRNAs(miR-155、miR-221、miR-181a、miR-320c和miR-885-5p)被下调，抑制BMSCs成骨分化。

研究表明，外泌体miRNA可以通过不同调控途径促进BMSCs成骨分化(图1a)。Chen等[14]发现，小鼠受体BMSCs能够从间充质干细胞移植(mesenchymal stem cells transplantation，MSCT)供体中摄取其包含的外泌体及miR-151-5p，通过过表达miR-151-5p抑制白细胞介素-4(IL4)/IL4Rα表达，下调磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR，p-mTOR)水平及其通路的级联反应，促进成骨基因Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx 2)、碱性磷酸酶(alkaline Phosphatase，ALP)及骨钙素(osteocalcin，OCN)表达上调，促进成骨分化。Wang等[15]研究发现，来自于间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分泌的外泌体源性miR-21在BMSCs成骨分化过程中表达上调，通过激活磷脂酰肌醇-3-羟激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K),磷酸化Akt(phosphorylated Akt，p-AKT)及糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)通路及靶向结合成骨分化抑制剂Spry1和Sox2发挥作用，上调Runx2表达促进BMSCs成骨分化。

外泌体miRNA还可以抑制BMSCs骨向分化(图1b)。来自MSCs分泌的外泌体miR-31通过下调Runx 2的下游成骨转录因子(osterix，OSX)和SATB2抑制BMSCs成骨分化[15]。此外，血红素加氧酶1(Hmox-1)可以促进BMSCs的生长和成骨分化[16]，而Hmox-1可以作为miR-183-5p的结合靶点[17]。以此为基础Davis等[18]发现，用来自骨髓间质液(bone marrow stromal fluid，BMSF)的外泌体miR-183-5p 模拟物转染BMSCs后会降低miR-183-5p靶向调控Hmox-1的蛋白水平，抑制BMSCs成骨分化。Liu等[19]发现过表达外源性miR-155会导致BMSCs成骨分化过程中ALP降低，下调成骨相关骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、OCN及OSX的表达，抑制BMSCs成骨分化；该研究还检测到Runx 2和骨形态发生蛋白Ⅱ型受体(bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2)是miR-155的两个直接靶基因，上调Runx 2和BMPR 2表达也可以抑制骨向分化。Liu等的实验只是提示miR-155来源于外泌体的可能性较大，但并未以实验确定，故后续研究可以以此为基础完善此作用机制。

还有研究表明，在外泌体源性miRNA调控BMSCs成骨分化过程中，改变miRNA表达水平后，其对BMSCs成骨分化的作用也随之改变(图1c)。Chen等[20]研究报道，当人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived stem cells，HADSCS)来源的外泌体miR-375表达降低后，其3′-非翻译区(3′-UTR)会抑制胰岛素样生长因子结合蛋白3(insulin-like growth factor binding protein 3，IGFBP3)表达，进而抑制BMSCs成骨分化；过表达miR-375后则促进BMSCs成骨分化。Qin等[21]发现，BMSCs来源的外泌体刺激BMSCs成骨分化，可能的调控机制是外泌体中高度富集的3种miRNA(miR-196a，miR-27a和miR-206)参与调控成骨分化，且其表达量高低会影响对BMSCs成骨分化的促进或抑制作用。

图1 外泌体miRNA对BMSCs成骨分化作用机制示意图Fig.1 Mechanism of exosomal miRNA on BMSCs osteogenic differentiation注：a: miRNA通过不同途径促进BMSCs成骨分化; b: miRNA通过不同途径抑制BMSCs骨向分化; c: 改变miRNA表达水平后，其对BMSCs成骨分化的作用随之改变。

综上可知，外泌体miRNA对BMSCs的成骨分化作用机制既有调控成骨分化相关基因表达，也有参与成骨分化信号通路调节，还可调控miRNA下游靶基因从而调控BMSCs成骨分化。然而，目前对外泌体源性miRNA的研究虽多，但关于其对BMSCs成骨分化的调控机制、作用时相应下游靶基因、表达时序性以及全身相关性疾病等问题的认识还是很局限，仍需进一步研究，以为临床诊断和治疗提供更为精确的靶点与方向。

2 外泌体lncRNA对BMSCs成骨分化作用机制

LncRNA是长度大于200个核苷酸的长链非编码RNA的一员[21]，比miRNA和circRNA序列更长，空间结构更复杂，稳定性更差且更易降解[22]，有研究[23]提示，在病理情况下lncRNA在外泌体中表达量比在细胞中表达量高，且可规避其被内源性RNA酶降解的风险，故经由外泌体进行物质交换和信息传递可提高lncRNA运输时的稳定性[24]，深入分析外泌体源性lncRNA对BMSCs成骨分化的作用机制极具研究价值和临床实用性。

研究发现，lncRNA可以促进BMSCs成骨分化。Zhang等[25]通过基因芯片检测技术和生物信息学分析筛选出了在BMSCs成骨分化过程中相关的1 048条lncRNA，深入研究后发现lncRNA XR-11150通过上调Runx 2表达促进BMSCs成骨分化。还有研究报道[26]，小干扰RNA(siRNA)转染lncRNA-DANCR后降低DANCR表达，促进BMSCs增殖及成骨分化，而过表达DANCR时，激活p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路，抑制BMSCs增殖和成骨分化(图2a)。目前的研究只提示了经由外泌体介导lncRNA促成骨分化效率更高，稳定性更好，但缺乏精确的实验数据证明lncRNA来源于外泌体，有待继续探索，以找寻更高效便捷的作用途径。

外泌体源性lncRNA也可以抑制BMSCs成骨分化。Li等[27]发现，骨髓瘤(multiple myeloma，MM)细胞来源的外泌体含有丰富的lncRNA Runx2-AS1，通过在重叠区域与Runx 2 premRNA形成RNA双链，降低剪接效率抑制BMSCs中Runx 2的表达，从而降低BMSCs的成骨分化潜能，且研究结果提示外泌体源性lncRNA Runx 2-AS1可能成为MM病变的潜在治疗靶点，更具研究意义(图2b)。Wang等[28]用微阵列技术确定肿瘤源性外泌体处理的BMSCs中lncRNA的全基因组表达模式后发现，肿瘤源性外泌体可通过差异表达lncRNA降低BMSCs内lncRNA和mRNA的表达水平，进而抑制BMSCs成骨分化，但其具体分子作用机制并未研究，有待深入探索。

尽管目前lncRNA已经成为研究热点，但关于外泌体源性lncRNA对BMSCs成骨分化作用的研究仍存在许多未知，有待深入研究，发现更多具有调控成骨分化作用的lncRNA以及更为精准的调控通路，为骨再生机制提供更多的可能性。

3 外泌体circRNA对BMSCs成骨分化作用机制

CircRNA是一类含有共价闭合环状结构的具有高稳定性、高保守性且被证明在外泌体中含量丰富的内源性非编码RNA[29]。外泌体源性circRNA已经开始在癌症研究的新领域中发挥功能性作用，参与胃癌和肿瘤的发生，发展及转移[30-31]，作为肿瘤性疾病的诊断标志物发挥了极大的作用[32]，但对BMSCs成骨分化作用机制的研究鲜有报道。

近期研究发现，外泌体源性circRNA可以作为miRNA分子海绵参与信号通路，调控BMSCs成骨分化。Zhang等[33]对BMSCs成骨分化过程中circRNAs的表达谱进行了微阵列分析，发现共有3 938个circRNAs上调，1 505个下调，并发现此过程中表达的circRNAs可以从基因组的所有区域合成，但主要来源于外泌体，经研究验证部分外泌体来源的circRNA与miRNA间呈负相关且具有miRNA反应元件，其中circRNA IGSF11沉默后提高了miR-199b-5p的表达水平，激活GSK-3β通路，促进BMSCs成骨分化(图2c)。

另外Yang等[34]在骨质疏松症(osteoporosis，OP)患者血清中发现，其miR-217水平较未患OP者高，miR-217通过靶向结合Runx 2的3′UTR位点降解Runx 2，抑制成骨分化；血清外泌体中circRNA VANGL1(circ-VANGL1)通过结合miR-217阻断其降低Runx 2表达的抑制成骨作用，且过表达circ-VANGL1后，ALP、Runx 2、OPN和OCN等表达均上调，促进BMSCs成骨分化。但Yang等的实验并未涉及circ-VANGL1是否能够单独作用以及circ-VANGL1能否与其他miRNA或mRNA位点结合，有待进一步研究，以期为促进骨再生提供新的治疗途径与方法(图2 d)。

图2 外泌体lncRNA和circRNA对BMSCs成骨分化作用机制示意图Fig.2 The mechanism of exosomes lncRNA and circRNA on BMSCs osteogenic differentiation注：a: lncRNA-DANCR通过不同途径抑制BMSCs成骨分化; b: lncRNA抑制BMSCs成骨分化; c: circRNA抑制BMSCs成骨分化；d: circRNA VANGL1通过不同途径促进BMSCs成骨分化。

综上所述，虽然circRNA在细胞生命活动、全身疾病的发生发展及作为疾病诊断早期标志物方面都显露了巨大的潜力[35-36]，但circRNAs的丰度较低，很难在外泌体中精确检测到，具有很大的挑战性，且其在外泌体中富集的机制可能是胞质中本就富含circRNAs，被动包含在外泌体中，也可能是circRNAs从细胞质主动转移，目前尚未有明确定论，故深入探究circRNAs是如何富集到外泌体中的及其调控BMSCs成骨分化的具体作用机制，有助于开创新的研究思路，并为骨科疾病提供全新的治疗体系。

4 小结与展望

已有多项研究报道外泌体对BMSCs成骨分化具有调控作用，如人脐带来源MSCs分泌的外泌体通过上调OCN、ALP、BMP 2、OSX、Runx 2等成骨相关基因，促进BMSCs成骨分化[37]。BMSCs来源外泌体通过促进BMP 9、Runx 2、OSX等表达促进成骨分化，或通过促血管再生、钙化沉积、黏附Ⅰ型胶原蛋白及纤维连接蛋白等细胞外基质附着于骨表面，间接诱导BMSCs骨向分化[38]。但关于外泌体内容物非编码RNA对BMSCs成骨分化的研究仍有限，目前已发现的研究机制主要集中在调控成骨分化相关基因表达、激活或抑制成骨分化相关通路、影响成骨上下游靶基因表达水平以及参与成骨分化相关蛋白表达等，多数研究是miRNA调控BMSCs成骨分化的作用，关于lncRNA和circRNA的相关研究较少，是未来的热点研究方向。此外，实现更加高效提纯外泌体非编码RNA成分并保证其生物学活性、发现更多能够调控BMSCs成骨分化的途径以及探索更多调控BMSCs成骨分化的作用机制等都有待研究。故深入研究外泌体非编码RNA对BMSCs发挥调控作用的成分并明确其调控BMSCs成骨分化的具体作用机制，有助于研发促进骨再生、抑制骨吸收的新途径和方法，对临床预防和治疗骨质疏松类疾病具有重要意义，研究及应用前景十分良好。