基于QuEChERS-高效液相色谱-质谱联用技术检测食用菌中8种烟碱类化合物

陈荣锋，陈凤明，潘裕添，张国广,，张 峰,

（1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.闽南师范大学菌物产业工程技术中心，福建 漳州 363000；3.国家卫生健康委职业安全卫生研究中心，北京 102308）

烟碱类化合物是一类含有氮杂环的碱性物质，目前已鉴定的有40多种，包括尼古丁、可替宁、新烟碱、二烯烟碱、去氢新烟碱、2,3’-二联吡啶、麦斯明、降烟碱8种主要的生物碱，其中尼古丁含量最高[1]。尼古丁会使人上瘾或产生依赖性，重复使用会增加心率和升高血压并降低食欲。大剂量的尼古丁会引起呕吐以及恶心，严重时人会死亡[2]。

2008年11 月，有德国实验室公布中国产牛肝菌干片尼古丁含量超标，德国禁止中国的牛肝菌干片在德国市场上销售[3]。随后牛肝菌干片在德国、意大利、法国等国的销售受到严重阻碍，牛肝菌面临在欧盟退市的危机[4]。我国科研工作者通过对不同品种食用菌的检测发现，很多野生食用菌中含有尼古丁，包括欧州在内的不同产地产品。最后根据实验结果结合调研情况得出结论：尼古丁在此类低等植物中是普遍存在的内源性微量物质。从而为中国的牛肝菌出口挽回巨大的经济损失。经欧盟食品安全委员会调查并对食用菌[5-9]中尼古丁限量作出紧急修订，尼古丁在食用菌鲜品和干品（不含牛肝菌）中最高限量分别为0.036 mg/kg和1.17 mg/kg，而在牛肝菌干品的最高限量则为2.3 mg/kg。此后，食用菌类中烟碱类物质引起了广大科研工作者的关注。

目前仅见检测烟草和体液中此类生物碱的研究，采用分光光度法[10-11]、光谱法[12-13]、毛细管电泳法[14]、气相色谱法[15-17]、液相色谱法[18-19]、气相色谱-质谱联用法[20-23]和液相色谱-质谱联用法[24-30]等。分光光度法针对官能团相同的化学性质，能够测定一类物质如烟碱类总生物碱的含量，但对于其中各生物碱含量则无法测定。光谱法建模较难，而且对于基质复杂样品专属性不强。电化学分析法和示波极谱法应用范围较小。毛细管电泳影响因素多，操作复杂。高效液相色谱法检测灵敏度不高，难以得到结构信息，在对复杂混合未知物的结构分析方面显得薄弱，在常规紫外检测器上对无紫外吸收化合物的检测和大量未知化合物的定性分析还需依赖于其他手段。而色谱-质谱联用技术结合了色谱技术对复杂基质的分离能力和质谱检测器高灵敏度高专属性的特点，对烟碱类化合物的检测更具有优势。

本研究对食用菌中8种烟碱类化合物用QuEChERS提取净化，高效液相色谱-质谱联用法进行分析研究，具有处理简便、灵敏度高、重复性好的特点，可满足食用菌中8种烟碱类化合物的快速测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜食用菌（银耳、香菇、黑木耳、猴头菇、口蘑）、屈臣氏纯化水 市场。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵（均为色谱纯） 美国迪马公司；可替宁（纯度99.8%）、降烟碱（纯度98.8%）、新烟碱（纯度98.7%）、二烯烟碱（纯度99.6%）、去氢新烟碱（纯度98.2%）、2,3-联吡啶（纯度98.7%）、麦斯明（纯度99.8%）、尼古丁（纯度99.3%）标准品 美国Chromadex公司。

1.2 仪器与设备

QTRAP 5500 LC/MS/MS系统超高效液相色谱-质谱联用仪（配备有电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）、高压二元泵、自动进样器、柱温箱） 美国AB SCIEX公司；ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相A为0.1%甲酸-10 mmol/L乙酸铵溶液、B为乙腈，等度洗脱（A∶B，20∶80，V/V），流速0.3 mL/min，进样量2 μL。

1.3.2 质谱条件

采用ESI源，正离子多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）扫描模式，气帘气流速20 L/h，雾化气流速55 L/h，辅助气流速55 L/h，辅助加热气温度650 ℃，喷雾电压5 500 V。去簇电压80 V，碰撞电压分别为25 V和35 V。一级全扫描范围为m/z50～500。

1.3.3 标准溶液制备

精密称取10 mg各标准物质，用乙腈溶解配制成质量浓度100 μg/mL的储备液，贮存于－4 ℃。精密吸取适量的储备液于容量瓶中，用流动相定容，配成0.03～500 ng/mL系列混合标准工作液。

1.3.4 样品溶液制备

食用菌子实体，包括菌盖和菌柄经冻干后粉碎混匀，待用。样品处理参考文献[5,20]的方法，取样品0.5 g（精确至0.01 g）置于50 mL试管中加入2 mL去离子水后涡旋2 min混匀样品，静置5 min后加入10 mL甲醇（含2%甲酸）涡旋10 min，加入3.0 g氯化钠至提取溶液然后再涡旋10 min，离心后取上层溶液3 mL至装有150 mg无水硫酸镁，50 mg PSA和50 mg C18净化试剂的试管中。涡旋5 min后离心，取上层溶液至干净试管中氮吹至干，加入200 μL初始流动相复溶后待测。

1.4 数据统计

采用Excel（2013版）进行处理计算，色谱优化结果采用Origin 9.1作图处理。

2 结果与分析

2.1 提取条件确定

用体积分数2%甲酸溶液、水、甲醇、2%甲酸-甲醇溶液、乙腈5种常见提取溶剂，分别超声提取处理，与QuEChERS方法提取处理比较，然后按色谱、质谱条件测定，以测定结果进行评价，结果发现，2%甲酸溶液和水提取后，很难吹干浓缩，样品检测结果小于定量限无法准确定量。

其余包括QuEChERS方法，检测结果在线性范围内，以测定结果回收率评价，QuEChERS提取测定回收率最高（图1），同时基质效应影响程度最小，综合评价，最终选定QuEChERS方法。

图1 不同提取方法回收率测定结果Fig.1 Effect of extraction methods on recoveries of eight nicotine compounds

2.2 色谱质谱条件确定

首先考察T3色谱柱，在等度洗脱条件下的结果，以乙腈为流动相B，A相为水相，考察A相体积分数分别为40%、50%、60%、70%和80%条件下8种目标物的保留情况，通过增加水相的初始浓度，二烯烟碱和2,3-联吡啶的保留时间逐渐延长，保留能力逐渐增加，但是其他6种目标物的保留能力没有明显增加。8种物质未能完全分离。

更换为HILIC色谱柱，以等度洗脱条件，A为乙腈，B为水相，考察体积分数分别为10%、20%、30%、40%和50%条件下目标物的保留能力，与T3色谱柱等度洗脱相比较，在初始水相为10%以上，随着水相比例增大，大部分目标物有所保留，目标峰保留效果有所改善，最终选择亲水性的HILIC色谱柱，参考文献[19,25,31]选择定性定量离子，建立MRM方法，每种化合物选择1 个定量离子和1 个定性离子。每种化合物的保留时间及定量、定性离子和碰撞能量见表1，不同标准品的选择离子色谱图见图2。

图2 不同烟碱类化合物标准品的选择离子色谱图Fig.2 Selective ion chromatograms of eight nicotine standards

表1 MRM的优化条件Table 1 Optimized conditions for multi-reaction ion monitoring

2.3 线性范围、检出限和定量限结果

将系列混合标准工作液注入液相色谱-质谱联用色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液的质量浓度（X）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，绘制校准曲线并列出校准曲线的线性方程和线性范围。如表2所示，本法线性范围较宽，在3 个数量级以上，线性相关系数（R2）大于0.99。

取上述1 ng/mL混合标准工作液0.2 mL加入到0.5 g空白基质中，按照1.3.4节同法处理，逐级稀释，过滤膜进行分析得出8种化合物的检出信号，以信噪比为10时对应的检出量为定量限，信噪比为3时对应的检出量为检出限，结果见表2。定量限及检出限较低，检出限为0.004～0.04 μg/kg，定量限在0.012～0.12 μg/kg之间，完全满足食用菌内烟碱类化合物测定的量值范围和最低检出量。

表2 烟碱类化合物线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear range, linear equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of each nicotine compound

2.4 准确度、精密度和基质效应结果

按照样品处理方法，分别在基质中加入3 个水平8种成分的标准物质溶液，配制低（0.5 μg/kg）、中（2 μg/kg）、高含量（10 μg/kg）供试品溶液，各含量平行配制6 份，根据标准曲线计算含量，计算加标回收率，结果见表3。8种烟碱类化合物的回收率在78.7%～107.8%之间，说明本法准确度高。

表3 烟碱类化合物加标回收率、基质效应和精密度（n =6）Table 3 Spiked recoveries, matrix effect and precision of each nicotine compound (n = 6)

按照样品处理方法，分别在基质中加入8种成分3 个水平的标准物质溶液，配制低（0.5 μg/kg）、中（2 μg/kg）、高含量（10 μg/kg）供试品溶液，每个水平平行配制6 份样品，分别于当日连续测定3 次和3 d内分别测定，代入当日标准曲线计算含量及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表3。本法的日内精密度为1.8%～10.3%，日间精密度在2.8%～11.1%之间。本法基质效应在81.5%～106.6%之间，说明用本方法处理的样品溶液在本仪器上测定，基质效应很小。

2.5 样品测定

随机抽取5 份市场购买的银耳等5种食用菌，按照本实验建立的QuEChERS方法处理后，采用本实验所建立方法检测，计算样品含量，结果见表4。5种食用菌中能检出除去氢烟碱外7种烟碱类化合物，本研究所建立方法完全能够满足真实样品的测定。食用菌样品中含量最高的为黑木耳中尼古丁（（40.301±0.634）μg/kg）。目前尚未有食用菌中8种烟碱类化合物成分的检测报道，只有研究测定部分食用菌中尼古丁含量，有报道牛肝菌中尼古丁含量为0.038～1.011 mg/kg，羊肚菌中尼古丁含量为0.009～0.561 mg/kg，姬松茸中尼古丁含量为0.011～0.725 mg/kg，松茸中尼古丁含量为0.002～0.216 mg/kg[20]。本研究测定结果与文献报道基本在相同水平范围内。

3 讨论与结论

色谱条件优化时，比较水-乙腈流动相梯度洗脱和50%～10%起始不同梯度等度洗脱，观察目标峰分离程度，最终选择本实验的等度洗脱条件。

本实验建立检测食用菌中8种烟碱类物质的QuEChERS-高效液相色谱-质谱检测方法，定量限和检出限分别在0.012～0.12 μg/kg和0.004～0.04 μg/kg之间，8种烟碱类化合物的回收率在78.7%～107.8%之间，日内精密度和日间精密度分别为1.8%～10.3%和2.8%～11.1%，符合残留分析要求。本方法简便、快速、准确、灵敏、分析时间短，完全满足对食用菌中尼古丁等内源性物质的检测。

目前鲜见同时检测食用菌中8种烟碱类化合物的报道，并且无法同时检测多种生物碱[23,31]，本实验建立了能够同时检测食用菌中8种烟碱类生物碱的方法，经5种食用菌检测验证，完全能够满足检测需求。文献报道的食用菌中烟碱类含量与本方法检测结果相近。QuEChERS-高效液相色谱-质谱联用技术目前逐步应用于食品微量物质检测，本方法克服了分光光度法、液相色谱紫外检测器、毛细管电泳检测过程繁琐、准确度差、检出限不能满足需求的缺点，既简化了前处理步骤，又在保证准确度的前提下，提高了灵敏度和专属性。