5′- 核苷酸酶与慢性乙肝患者肝损伤的关系

阳建华，王芬，张文崇

（1.上栗县中医院，江西 上栗 337000；2.奉新县中医院，江西 奉新 330700）

慢性乙肝是指乙肝病毒（HBV）持续感染引起的肝脏慢性炎症性疾病，世界上感染过乙肝的人数超过20 亿，该病早已成为全球性的公共卫生问题[1]。 尽管我国实施的乙肝防治策略有效的降低了HBV 感染率，但由于人口基数大，仍面临巨大的疾病防控压力[2]。 肝脏解剖位置及生理功能特殊，易受多种因素影响导致肝损伤，而慢性乙肝患者肝损伤越严重，其生存质量越低[3,4]。循证医学证明，早期筛检、不断诊断检测、后续追踪治疗等方法可有效控制慢性乙肝病情发展，甚至可逆转肝硬化进程[5]。 肝穿刺活检是目前评估慢性乙肝肝损伤的金标准，有创的穿刺活检可能导致大出血等严重并发症，患者常常难以接受[6]；目前常用血清学指标敏感性和特异性仍存在不足[7]。 因此，寻找可以反应组织学形态的变化，并且具备一定灵敏度及特异性的指标是当前的研究热点。 研究表明，肝病患者血清中可检测到5’-核苷酸酶（5’-NT）活性明显增高，但其应用于肝损伤的报道仍然较少[8]。 本研究检测并分析了慢性乙肝患者血清5’-NT 水平对肝损伤的预测效果，以期找到慢性乙肝肝损伤潜在预测标志物。

1 对象和方法

1.1 研究对象

1.1.1 一般资料 选择2020年4月至2021年6月我院收治的慢性乙肝患者300 例进行研究，其中男性184 例，女性116 例，平均年龄41.02±11.31岁，根据相关症状及生物化学检查结果，将其分为轻度损伤组104 例、 中度损伤组139 例及重度损伤组57 例；对照组为同期治疗的非活动性乙肝表面抗原（HBsAg）携带者/慢性乙型肝炎病毒（HBV）携带者80 例，其中男性48 例，女性32 例，平均年龄39.63±10.56岁。 纳入研究的慢性乙肝患者和对照组的性别、年龄等一般资料具有可比性（P＞0.05），所有病例均经充分知情并签署知情同意书，研究通过我院伦理委员会审批。

1.1.2 入选和排除标准 入选标准：⑴根据《慢性乙型肝炎诊断标准（2015年版）》[9]进行诊断，①轻度损伤：ALT≤3×ULN（正常上限升高倍数），胆红素（BIL）17.1～34.2 mol/L，白蛋白（ALB）≥35 g/L，凝血酶原活动度（PTA） 79～71（%）；②中度损伤：ALT 3～10×ULN，BIL 34.2～85.5 mol/L，ALB 33～34 g/L，PTA 61～70（%）；③重度损伤：ALT＞10×ULN，BIL＞85.5 mol/L，ALB≤32 g/L，PTA 40～60（%）；中、重度损伤认为具有显著肝损伤。 ⑵既往未接受抗乙肝病毒治疗； ⑶此次发病就诊前未接受护肝降酶等治疗。

排除标准：⑴乙肝病毒感染病史不明确者；⑵出现腹膜炎等严重感染的并发症患者； ⑶合并HIV、寄生虫、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、巨细胞病毒及其他嗜肝病毒等感染者；⑷合并药物性肝炎、 酒精性肝病、 自身免疫性肝炎、肝脏肿瘤等肝脏疾病患者；⑸合并妊娠、甲状腺功能亢进、精神性疾病、呼吸系统疾病、心肾功能不全、自身免疫性疾病等其他系统疾病；⑹近1年内曾接受或正在接受免疫调节药物治疗，或存在其他原因引起免疫系统功能异常者。

1.2 血清指标检测 所有病例于就诊治疗初采集清晨空腹新鲜外周血送检，采用AU480 全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特有限公司） 检测ALT、AST 等肝功能指标；同时抽取外周血4 ml 于含分离胶促凝管，3000 r/min 离心10 min 后，分别取上层血清4 份，每份200 μl，置于Eppendof 管中，-80℃条件下存放，待检。 采用实时荧光定量聚合酶链反应法测定HBV DNA，设备为Veriti7500实时荧光定量PCR 仪（ABI Thermo 赛默飞世尔）；采用酶联免疫吸附测定法检测所有患者血清5’-NT。

1.3 统计学处理 使用SPSS 25.0 进行数据分析，计量资料以（均数±标准差）表示，多组采用单因素方差分析进行比较，两组则采用t 检验比较；计数数据以n（%）标示，应用卡方（χ2）检验进行分析。采用Pearson 相关进行相关性分析；通过单因素及多因素Logistic 回归考察肝损伤的影响因素； 绘制ROC 曲线确定5'-NT 的对肝损伤的诊断效能。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同肝损伤影响因素分析 将所有慢性乙肝患者分为显著肝损伤和轻度肝损伤并进行比较，结果发现ALT、AST、HBV DNA 及5'-NT 水平存在差异（P＜0.05），而不同肝损伤患者的性别和年龄无明显差异（P＞0.05）。 见表1。

表1 不同肝损伤影响因素分析

2.2 各组病例ALT、AST、HBV DNA 及5'-NT 水平比较 单因素方差分析可知，不同肝损伤病例的ALT、AST、HBV DNA 及5'-NT 水平具有显著差异（P＜0.05），发生肝损伤的病例的ALT、AST、HBV DNA 及5'-NT 水平均显著高于对照组病例（P＜0.05），且随损伤程度加深，各指标水平呈现递增趋势。 见表2。

表2 不同肝损伤病例ALT、AST、HBV DNA 及5′- NT 水平比较

2.3 5'-NT 与ALT、AST 及HBV DNA的相关性Pearson 相关显示，5'-NT与慢性乙肝ALT（r=0.506，P＜0.001）及AST（r=0.524，P＜0.001）呈显著正相关，而与HBV DNA 无明显相关性（P＞0.05）。见表3。

表3 5′- NT 与ALT、AST 及HBV DNA 的相关性

2.4 多因素Logistic 回归分析 以不同肝损伤情况为因变量（显著肝损伤=1，轻度肝损伤=0），自变量为单因素分析中具有显著影响的因素，其赋值分别为：ALT （＞3×ULN=1，≤3×ULN=0）、AST （＞3×ULN=1，≤3×ULN=0）、HBV DNA （＞5.3 lg copies/ml=1，≤5.3 lg copies/ml=0）及5'-NT（＞12.20 U/L=1，≤12.20 U/L=0） 进行多因素Logistic 回归分析，结果ALT （OR=3.813，95%CI 1.281-11.350）、AST（OR =4.512，95% CI 1.540 ～13.220）、HBV DNA（OR=3.624，95%CI 1.215～10.808）及5'-NT（OR =3.936，95%CI 1.341～11.554） 是影响显著肝损伤发生的独立危险因素。 见表4。

表4 多因素Logistic 回归分析

2.5 各参数对肝损伤的诊断效能 以发生显著肝损伤赋值为1，轻度肝损伤则赋值0，绘制各参数预测肝损伤的ROC 曲线，结果显示5'-NT 的ROC曲线下面积为0.876，约登指数为0.65，其敏感度和特异性均达到80%以上，对肝损伤具有最高的诊断效能。 见图1 和表5。

图1 各参数对肝损伤的诊断效能的ROC 曲线

表5 各参数对肝损伤的诊断效能表5 各参数对肝损伤的诊断效能

3 讨论

肝损伤常见类型有药物性、 酒精性及免疫性肝损伤，其中免疫性肝损伤表现为机体开始排斥自身肝组织，一旦肝组织出现炎症性损伤时，会导致相应的抗体在血清中出现；目前，对于免疫性肝损伤病因尚不清楚，但有很多患者可以迅速发展为肝硬化和肝衰竭[10]。 HBV 引起的肝损伤属于免疫性肝损伤；HBV 是一种非细胞毒性病毒，并不直接引起肝损伤，而是由于感染HBV 后引起人体细胞免疫和体液免疫应答造成的，是由机体针对HBV 特异性抗原的免疫反应所引起，因此，机体的免疫状态变化会使得HBV 感染所致的临床结果发生变化[11]。 故慢性乙肝难以从单独的临床表现确诊，需综合病史、特定的实验室检查及组织学观察予以诊断。 因此，筛查出与慢性乙肝发生肝损伤相关的生物标志物具有极大的临床意义。

5’-NT 是一种分布于肝脏的胆小管、 窦状隙以及各种组织细胞膜内的特异性磷酸酶，可通过炎症抑制、A2A 受体调控、调节性T 细胞等多种途径参与机体免疫，免疫抑制活性广泛；5’-NT 在肝细胞受损或肝内外受阻时才能释放入血，而其他细胞组织不会释放5’-NT，且其他合并系统脏器疾病并不能影响血中5’-NT 的浓度，故血清5’-NT 对于肝脏疾病具有重要的诊断价值[12,13]。刘少平等[14]研究表明，5’-NT 在肝癌组织中水平高于良性肝病患者，二者均较健康人高；邓霁红等[15]研究发现，乙肝患者的血清5’-NT 水平显著高于健康人群，且随着HBV-DNA 载量增加，5’-NT 水平有所增加，但其研究中并未发现血清5’-NT 和HBVDNA 间的明显关系。 而本研究不同程度肝损伤病例的5'-NT 水平差异显著，发生肝损伤的病例的5'-NT 水平均显著高于对照组病例（P＜0.05），且随损伤程度加深，5'-NT 水平呈现递增趋势，提示不同程度的慢性乙肝导致的肝损伤引起血清5'-NT水平发生了明显变化，这也再次证明血清5'-NT可能是慢性乙肝肝损伤的诊断标志物。

ALT 和AST 是临床上应用最广泛的肝损伤生化指标，当致病因子导致肝细胞发生变形，细胞膜通透性进而改变则会引起ALT 的升高，而AST 上升会晚于ALT，一般需肝损伤波及到线粒体时才会出现[10]。 HBV DNA 是HBV 感染的特异性指标，其水平高低可用于直接评估HBV 复制程度[16]。HBV 病毒的反复入侵导致免疫清除/激活长期持续出现，进而诱发肝硬化，而血清HBV DNA 水平可预测HBV 慢性感染者的肝硬化发病率，肝硬化的发病率以剂量依赖方式，随HBV DNA 水平的增加而升高[17,18]。 Pearson 相关显示，5'-NT 与慢性乙肝ALT （r=0.506，P＜0.001） 及AST （r=0.524，P＜0.001）呈显著正相关，而与HBV DNA 无明显相关性（P＞0.05）。说明5'-NT 与肝功能有良好的的相关性，可能是反映肝脏炎症及其他损伤程度，但并未证明HBV-DNA 与肝功能间明显联系，故5'-NT与HBV 复制能力无明显关系，具体仍有待进一步研究予以证实。

研究还发现，显著肝损伤患者的ALT、AST、HBV DNA 及5'-NT 水平显著高于轻度肝损伤患者（P＜0.05）； 多因素Logistic 回归结果可知ALT（OR =3.813，95% CI 1.281 -11.350）、AST （OR =4.512，95% CI 1.540 -13.220）、HBV DNA （OR =3.624，95% CI 1.215 -10.808） 及5' -NT （OR =3.936，95%CI 1.341-11.554） 是导致慢性乙肝患者出现显著肝损伤的独立危险因素。 由此可知，5'-NT 可用于慢性乙肝肝损伤的预测生物标志物。 为确定其诊断效能，以血清5'-NT 水平12.20 U/L 作为预测的临界值绘制ROC 曲线，结果5'-NT 的曲线下面积为0.876，敏感度和特异性均超过80%，与ALT、AST 及HBV DNA 相比具有最大的约登指数，说明5'-NT 对于慢性乙肝肝损伤表现出较高的诊断效能。 但慢性乙肝影响因素众多，常需结合多种指标进行综合评估，有报道5'-NT 联合其他多项指标可提高肝癌的阳性诊断率[19]，故5'-NT 在实际应用时亦可借鉴参考。

综上，血清5'-NT 水平升高可能提示慢性乙肝患者肝损伤加重，可作为预测慢性乙肝肝损伤的新型生物标志物。