平菇天然黑色素的提取优化及理化性质表征*

刘 芹，胡素娟，崔 筱，宋志波，孔维丽，康源春

（河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所，河南 郑州 450002）

黑色素是一种具有复杂结构的多酚类或吲哚类物质，广泛存在于各种生物体中[1]。黑色素具有抗氧化[2]、抗肿瘤[3]、抗蛇毒素[4]、抗辐射[5]等作用，且生物活性高。近年来，黑色素和黑色素样分子（melanin-like molecules） 在生物医学领域的应用得到了广泛的关注，如生物成像、光热治疗、药物释放系统等[2]，并且由于其优异的生物相容性和生物降解性，黑色素作为功能材料也被广泛应用于多个领域[6]。许多大型真菌都含有黑色素，这使得真菌成为获取黑色素的重要来源。真菌黑色素的合成途径有2种：1，8-二羟基萘 （DHN） 合成途径和多巴（DOPA）合成途径。在DHN合成途径中，丙二酰辅酶A在聚酮化合物合成酶的作用下生成的四羟基萘（1，3，6，8-THN），再经过一系列反应形成DHN，DNH进一步聚合形成黑色素[7]。大多数真菌黑色素是经过DHN合成途径生成的，只有少数真菌通过DOPA途径产生黑色素，这与哺乳动物中黑色素的生物合成途径相似，是以L-多巴或酪氨酸为起始分子，经过一系列的反应合成二羟基吲哚，然后进一步聚合形成黑色素[8]。黑色素对真菌的发育不是必需的，但是据研究表明，黑色素具有“真菌装甲”的作用，可以保护微生物免受有害环境的影响。体外研究表明，黑化真菌对极端温度、水解酶、重金属毒性和抗菌药以及对紫外线诱导和氧化剂诱导产生的损伤的抵抗力高于非黑化真菌，并且黑色素可以在不利条件下提高真菌的存活率。由于其强大的自由基清除活性，可成为真菌在环境胁迫下产生活性氧自由基时清除自由基的“海绵”[9]。目前，关于食用菌的黑色素研究较少[6]，黑色素研究主要集中于动物、植物和细菌类微生物，但是存在植物生长速度慢、动物饲养成本高、微生物安全性较低等缺点。而食用菌子实体的生长速度快，易于工厂化栽培，并且安全性有保障，是一种很有前途的黑色素生产替代品[10]。

平菇（Pleurotus ostreatus） 是世界上栽培最广泛的食用菌之一[11]，由于其丰富的营养（如膳食纤维、蛋白质、矿物质和维生素）、显著的抗氧化、抗病毒、提高免疫力等生物活性而受到消费者的青睐[12]。平菇易于栽培，可以在各种农业副产物（玉米芯、秸秆、麸皮等）上生长，其年产量在世界范围内持续快速增长[13]。平菇是我国第三大食用菌栽培品种，生长周期短、成本低，工厂化程度高，基本可以实现全年稳定供应，2019年平菇全国年产量高达686.47万吨[14]，因此，平菇可作为一种新型天然黑色素来源进行深入研究。

通过响应面法优化平菇黑色素的提取方法以获得最佳的提取条件，此外，对平菇黑色素的溶解性、光稳定性、热稳定性、金属离子稳定性和抗氧化活性进行了检测，以期为平菇黑色素的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜平菇子实体采摘自河南省农业科学院食用菌研究室原阳二基地。

1.2 试剂与仪器

氯仿、丙酮、乙酸乙酯、氢氧化钠（NaOH）、盐酸（HCl）和无水乙醇均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）和ABTS[2，2′-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）]，购自美国Sigma公司。

D3024R高速冷冻离心机，美国Scilogex公司；HH-4数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；电子天平，瑞士Mettler Toledo有限公司；普析GWB-1纯水仪，北京普析通用仪器有限责任公司；PS-60AL超声仪，深圳市雷德邦电子有限公司；电热鼓风干燥箱，龙口市先科仪器公司；UV-2550紫外-可见分光光度仪，美国Lab Tech公司；pH计，美国Sartorius公司。

1.3 平菇原料前处理

平菇子实体采用蒸馏水清洗干净，50℃热风干燥至恒重。干制平菇样品粉碎过250 μm标准筛，干燥器中保存待用。

1.4 响应面法优化平菇黑色素的提取

1.4.1 黑色素的提取

称取平菇样品粉末，按照一定料液比加入NaOH溶液，超声水浴抽提。离心（9 500 r·min-1，15 min），收集上清液并调节pH至1.5，80℃再次水浴12 h。将提取液离心 （8 000 r·min-1，10 min），收集沉淀即为黑色素粗品。将得到的黑色素粗品反复酸沉碱溶3次～4次，最后将获得的黑色素采用蒸馏水漂洗至pH 7.0，干燥后保存。

1.4.2 单因素试验

分别对NaOH浓度（0.25 mol·L-1～1.50 mol·L-1）、料液比 （1∶10～1∶60）、超声时间 （10 min～60 min）、超声功率（200 W～400 W） 和超声温度（20℃～70℃）进行单因素试验，研究5个因素对黑色素获得率的影响。黑色素获得率（Y，%）的计算公式为：

式中：m为平菇黑色素的质量（g）；M为平菇子实体粉末质量（g）。

1.4.3 响应面法试验的设计

优化试验的设计采用Box-Behnken响应曲面法，应用软件Design-Expert 8.0对影响黑色素提取的主要因素进行研究分析，以获得最佳提取条件。

1.5 平菇黑色素理化性质

1.5.1 平菇黑色素溶解性

称取0.01 g平菇黑色素干品分别与5 mL的1.0 mol·L-1NaOH、1.0 mol·L-1HCl溶液、无水乙醇、75%乙醇水溶液、氯仿、去离子水、丙酮、乙酸乙酯混合均匀，室温静置0.5 h，观察黑色素的溶解性。

1.5.2 平菇黑色素热稳定性

称取0.01 g平菇黑色素干品溶于10 mL的0.1 mol·L-1NaOH溶液中，分别置于20℃、40℃、60℃、80℃和100℃水浴中。每隔1 h取1次样，共取6次。冷却至室温后，8 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液用紫外可见分光光度计在波长210 nm处测定吸光值。

1.5.3 平菇黑色素光稳定性

称取0.01 g平菇黑色素干品溶于10 mL的0.1 mol·L-1NaOH溶液中，分别置于黑暗、自然光和强光下，每隔12 h取样一次，共72 h，在210 nm处测定吸光度值。

1.5.4 平菇黑色素金属离子稳定性

称取0.01 g平菇黑色素干品溶于10 mL的0.1 mol·L-1NaOH溶液中，溶液中各含有 0.01 mol·L-1的金属离子 （Ca2+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Al3+、K+、Na+和Mg2+），未加金属离子的NaOH溶液为空白对照。每隔12 h取样一次，共72 h，在210 nm处测定吸光度值。

1.5.5 平菇黑色素氧化还原特性

向0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL还原剂（30% Na2SO3）和氧化剂（30% H2O2）中添加1.0 mg·mL-1平菇黑色素溶液使总体积为5 mL。后用蒸馏水稀释至10 mL，摇匀试管，静置30 min，测定210 nm处的吸光度值。另外，将1.0 mg·mL-1的KMnO4溶液与1.0 mg·mL-1平菇黑色素溶液等体积混匀，静置30 min，观察颜色变化。

1.5.6 平菇黑色素的抗氧化活性

1） DPPH自由基清除率

分别取 2 mL不同浓度 （0.25 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1、1.00 mg·mL-1、2.00 mg·mL-1和 4.00 mg·mL-1）的平菇黑色素溶液与2 mL的0.2 mmol·L-1DPPH溶液混匀，黑暗反应30 min后取出，测定517 nm处吸光度值（A1），用等体积的无水乙醇代替DPPH溶液，测定吸光度（A2），用等量去离子水代替黑色素溶液，测定吸光度（A0）。DPPH自由基清除率（C1，%）的计算公式为：

2） ABTS自由基清除率

将ABTS溶液（7 mmol·L-1）与过硫酸钾溶液（2.45 mmol·L-1）混合，黑暗中孵育16 h，制备ABTS·+。用乙醇稀释ABTS溶液，使其在734 nm处吸光度值为0.70±0.02。取0.2 mL不同浓度的黑色素样品与3 mL的ABTS溶液混匀，室温下黑暗中反应60 min，在734 nm处测定吸光度（A3）。将ABTS溶液替换为等体积的蒸馏水，测定吸光度（A4）。用等量去离子水代替黑色素溶液，测定吸光度（A0）。ABTS·+清除率（C2，%）的计算公式为：

1.5.7 平菇黑色素紫外-可见光谱扫描

称取0.01 g平菇黑色素干品溶于10 mL的0.1 mol·L-1NaOH 溶液中，离心 （8 000 r·min-1，5 min），在200 nm～400 nm的波长范围内对收集的上清液进行光谱扫描。

1.6 数据分析

所有的试验重复测量3次，采用SPSS 17.0统计软件中的ANOVA法进行显著性差异分析，差异显著性为P<0.05。采用Design-Expert 8.0软件，对响应面进行多元二次回归分析，建立黑色素得率的二阶响应回归模型，并对回归模型进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

NaOH浓度、料液比、超声时间、超声功率和超声温度5个因素对黑色素获得率的影响，详见图1。

图1a为NaOH浓度对平菇黑色素得率的影响。如图所示，黑色素得率随NaOH浓度的升高而不断增加，并当NaOH浓度为0.75 mol·L-1时达到最大值，此后，黑色素得率不断下降。这是因为NaOH溶液浓度过高时，碱性较大，破坏了黑色素的结构，从而导致黑色素得率降低[15]。因此，最终选取NaOH溶液浓度为 0.75 mol·L-1。

图1b为料液比对平菇黑色素得率的影响。如图所示，在料液比为1∶10～1∶60时，黑色素的得率随着溶剂用量的增加而升高。这是因为增加溶剂体积有助于增加溶剂与提取物的接触面积，平菇黑色素可以更好的溶解。但是考虑到试验过程中料液比太大会增加试验成本，不利于实验室资源的节约，因此最终选取的料液比为1∶40。

图1c为超声功率对平菇黑色素得率的影响。如图所示，平菇黑色素的得率随超声功率的增加而不断增加，并在超声功率为280 W时达到最高值，随后逐渐下降。这是因为随着超声功率的增加，空化作用增强，从而黑色素得率增加；但随着超声功率的进一步增加，抽提液的流动速度加快，导致材料在超声场中停留时间减少，从而削弱了破壁效果[5]。因此，最终选取的超声功率为280 W。

图1d为超声温度对平菇黑色素得率的影响。如图所示，平菇黑色素的得率随提取温度的升高而不断增加，并在60℃后基本保持不变。过高的提取温度将导致黑色素的生物活性下降和能量消耗的增加。因此，最终选取的超声温度为60℃。

图1e为超声时间对平菇黑色素得率的影响。如图所示，黑色素得率在提取时间为40 min时达到最大值。抽提时间过短，黑色素与蛋白质、多糖等物质解离不充分，黑色素得率不高。当抽提时间大于40 min后，黑色素的得率随抽提时间的增加而减少。这可能是由于提取过程在高温水浴下进行，抽提时间过长，溶剂水的过度蒸发造成提取液浓度升高、料液比下降（图1b），从而导致黑色素得率下降[15]。因此，最终选取的超声时间为40 min。

图1 5个因素分别对平菇黑色素获得率的影响Fig.1 The effects of five factors on the yield of melanin in Pleurotus ostreatus

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验结果

单因素试验表明，NaOH浓度、超声时间、超声功率3个因素对平菇黑色素的产率影响较大。因此，在料液比为1∶40，超声温度为60℃的前提下，根据单因素试验结果确定上述3因素的水平范围，见表1。

利用Design-expert软件进行响应面试验设计并以平菇黑色素获得率作为响应值，对Box-Benhnken试验设计及结果见表2。

表2 Box-Benhnken试验设计及结果Tab.2 Box-Behnken experimental design and experimental results

对Box-Benhnken设计试验结果进行二次多相回归拟合，得到黑色素获得率（Y）对NaOH浓度、超声时间、超声功率的多元回归方程为：

采用方差分析（ANOVA）来评估该拟合模型的有效性，见表3。

表3 响应面分析试验方差分析结果Tab.3 Analysis of variance for the developed regression model

由表3可知，整体模型的P<0.000 1，表明该二次方程模型极显著。并且，A、B、AB、A2、B2、C2对黑色素的得率影响极显著。模型失拟项表示的是模型预测值与实际值不拟合的概率，该模型失拟项P=0.324 6>0.05，表示水平不显著，说明该方程对试验拟合较好[16]。决定系数值（R2=0.999 1） 和调整过后的决定系数值（R2adj=0.998 0） 表明自变量与响应值之间具有很好的相关性[5]。

2.2.2 最佳工艺条件的预测与检验

通过三维响应面和二维等高线图展示了各因素对平菇黑色素获得率的影响，NaOH浓度与超声功率对黑色素获得率的影响见图2a、2b，NaOH浓度和超声时间对黑色素获得率的影响见图2c、2d，超声功率和超声时间对黑色素获得率的影响见图2e、2f。

如图2所示，利用Design-Expert 8.0软件对试验模型进行预测，得到平菇黑色素的最佳提取条件为：NaOH浓度0.58 mol·L-1，超声功率286.04 W，超声时间39.89 min，此条件下响应预测值为2.204 5%。结合实际，调整各因素为：NaOH浓度为0.60 mol·L-1，超声功率280 W，超声时间40 min。在此条件下进行3次平行试验验证，最后得到的平菇黑色素得率为2.19%，与预测值相差不大，证明了该模型设计的可靠性。

图2 两两因素对平菇黑色素产量的影响Fig.2 Effects of pairwise factors on the yield of Pleurotus ostreatus melanin

2.3 平菇黑色素溶解性

系统研究了平菇黑色素在1.0 mol·L-1盐酸溶液、无水乙醇、1.0 mol·L-1NaOH溶液、75%乙醇水溶液、氯仿、蒸馏水、丙酮、乙酸乙酯中的溶解性，结果见表4。

由表4可知，平菇黑色素在强碱（NaOH） 溶液中的溶解度较高，在其余溶剂中的溶解度较低。平菇黑色素的溶解特性与粗毛纤孔菌（Inonotus hispidus） 黑色素非常相似[5]。

表4 平菇黑色素的溶解性Tab.4 Solubility of Pleurotus ostreatus melanin

2.4 平菇黑色素稳定性能

此外，试验研究了光照、温度、金属离子和脱氧剂等环境对平菇黑色素稳定性的影响。热稳定性和光稳定性见图3。

如图3可知，碱性溶液中的黑色素具有一定的热稳定性和光稳定性，但强光和高温对其稳定性有很大的影响，随着处理时间的增加，黑色素的吸光值均呈下降的趋势。在对黑色素进行光激发试验中发现，黑色素能量产生消耗，单体内部存在质子转移，导致结构发生变化。但结构变化并不意味着黑色素的光稳定性差，而是黑色素在吸收了有害的紫外辐射后，将光能转化为无害热量[15]。黑色素这种独特的能力，使其成为一种优良的光保护剂。

图3 平菇黑色素的稳定性统计Fig.3 Statistic of stabilily performance of Plewotus ostreatus melanin

金属离子对平菇黑色素稳定性的影响见图4。

如图4所示，在使用的金属离子中，Cu2+对平菇黑色素的稳定性具有最显著的影响，这可能与金属离子与黑色素的相邻酚羟基之间的复杂反应有关[5]。与对照相比，其余的金属离子对黑色素的稳定性无显著影响。

图4 平菇黑色素的金属离子稳定性Fig.4 The metal ion stability of Pleurotus ostreatus melanin

脱氧剂环境对平菇黑色素稳定性的影响见图5。

图5 平菇黑色素在Na2SO3和H2O2中的氧化还原特性以及对KMnO4溶液的褪色作用Fig.5 The redox properties of melanin in Na2SO3and H2O2and melanin discolors KMnO4solution.

如图5A所示，还原剂Na2SO3对平菇黑色素的稳定性无显著影响，但氧化剂H2O2明显降低了平菇黑色素的稳定性。如图5B所示，平菇黑色素使KMnO4溶液发生了明显的褪色，由紫红色褪色为浅绿色，平菇黑色素的氧化还原性质与粗毛纤孔菌黑色素类似[5]。

2.5 平菇黑色素的抗氧化活性

相对稳定的有机自由基DPPH被广泛用于各种化合物的抗氧化活性测定[17-18]。DPPH·有一个单电子，在乙醇中呈紫色并且在517 nm处有很强的吸收。抗氧化剂可以与DPPH·的单电子配对，从而逐渐降低溶液的颜色[19]。ABTS·+则是用于测定单一化合物以及其他复杂混合物的抗氧化活性最常用的有机自由基之一[20]。平菇黑色素对DPPH·和ABTS·+的清除率见图6。

由图6可知，平菇黑色素对DPPH自由基的清除率随着黑色素浓度的增加而增加，呈现出一定的剂量依赖关系。当平菇黑色素浓度为0.50 mg·mL-1时，对DPPH自由基清除率达到70.23%。平菇黑色素对DPPH自由基的清除活性明显高于黑芝麻黑色素 （47.70%）[21]。当浓度为0.50 mg·mL-1时，平菇黑色素对ABTS·+的清除率为40.24%，低于对DPPH自由基的清除作用。

图6 平菇黑色素的抗氧化活性Fig.6 The antioxidant activity of Pleurotus ostreatus melanin

2.6 平菇黑色素紫外光谱特征

平菇黑色素紫外光谱图见图7。

图7 平菇黑色素的紫外-可见吸收光谱Fig.7 UV-visible absorption spectra of Pleurotus ostreatus melanin

由图7光谱扫描结果表明，平菇黑色素在210 nm处有最大吸收，并向可见光区域降低（图7a），这一现象是黑色素的关键特征，与毛木耳[5]和粗毛纤孔菌[15]黑色素的研究结果一致，这是因为黑色素分子中存在复杂的共轭结构。此外，平菇黑色素的吸光度值随波长的增加几乎呈线性降低，其吸光度值的对数（lg）对波长会产生负斜率为-0.002 8的线性曲线（图7b），这是黑色素的特征之一[22-23]。在260 nm和280 nm处未发现明显的吸收峰，表明核酸和蛋白质杂质的含量很小[17]，这说明所采取的提取方法效果良好，方法可靠。

3 结论

通过单因素试验和Box-Behnken试验设计以及响应面分析法，对平菇黑色素的提取条件进行优化，得出最佳提取条件为：料水比为1∶40，提取温度为60℃，NaOH浓度为0.60 mol·L-1，超声功率280 W，超声时间40 min，在此条件下检测的黑色素得率为2.19%，与理论值相差不大。得到黑色素的得率与各反应因素变量的二次回归方程模型，该模型回归极显著，对试验拟合较好，具有一定的应用价值。理化试验结果表明，平菇黑色素在碱性条件下具有良好的溶解性，不溶于水、酸溶液和有机溶液；平菇黑色素的最大光吸收波长为210 nm，此外，该黑色素具有一定的热稳定性和耐光性，并且对大多数金属离子表现出稳定性。平菇黑色素表现出较强的抗氧化性，当浓度为0.50 mg·mL-1时，平菇黑色素对DPPH·和ABTS·+的清除率分别为70.23%和40.24%。本研究为平菇黑色素及其深加工产品的应用和开发提供了新思路。但是，对于平菇黑色素的其他研究如其在平菇体内的分布和代谢、在食品和生物医学领域的应用，有待于进一步研究。