血管生成相关生物标志物与非小细胞肺癌PD-1免疫治疗疗效的相关性分析

文彩虹 冯晓庆

(1. 三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 肿瘤科， 湖北 宜昌 443003; 2. 三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 口腔科， 湖北 宜昌 443003)

近年来免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICI)的应用改变了晚期肿瘤的治疗模式，部分晚期肿瘤患者生存显著获益[1-2]。PD-1免疫治疗在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)领域的应用范围日益增加，尤其是驱动基因阴性的晚期患者，免疫治疗逐渐成为一线及后线的重要治疗手段，但总体客观缓解率(objective response rate，ORR)仅20%左右[3]。因此，筛选能够预测疗效的生物标志物尤为重要。虽然目前已经提出了一些预测ICI疗效的标志物，如PD-L1(programmed cell death 1 ligand 1)蛋白表达水平、微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)和肿瘤突变负荷(tumor mutation burden，TMB)等[4-5]，但这些检测往往需要肿瘤组织样本，不便于动态监测和评估。

肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移过程中的标志性事件，主要用于传递肿瘤生长和转移所需各种营养物质、生长因子、氧气等[6]。血管生成是一个复杂、动态的生物学过程，包括血管内皮基质降解，血管内皮细胞的增殖、出芽、迁移等[7]。血管生成是肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)变化的重要事件，ICI联合抗血管治疗已经成为肺癌重要的治疗手段[8]，血管生成相关生物标志物与免疫治疗的疗效及预后的关系尚不清楚。本研究探索了与血管生成相关的17种因子在肺癌患者行PD-1免疫治疗时的表达差异，以期找到新的免疫治疗疗效预测标记物，从而为临床实践提供更好的指导。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取2018年1月-2019年9月在我院肿瘤科行PD-1抗体免疫治疗的56例晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)NSCLC患者作为研究对象。依据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第8版分期标准对患者进行TNM分期，患者临床及随访资料完整。

1.2 入选标准和排除标准

入选标准：①年龄18～70岁；②病理诊断为NSCLC，临床分期为Ⅲ期或Ⅳ期；③至少接受2个周期ICI治疗。排除标准：①存在EGFR、ALK、ROS1、BRAF等驱动基因突变；②存在第二部位原发肿瘤；③合并严重肝、肾功能损伤的基础性疾病；④患有严重自身免疫性疾病。所有患者均对该研究内容知情，并签署知情同意书。

1.3 治疗方法

所有患者在第1次PD-1抗体治疗前1天，空腹抽取外周血4 mL，检测血清血管生成相关生物标志物浓度(详见1.4检测方法)。PD-1单抗用药方法：派姆单抗(美国默沙东公司)采用标准的3周方案，剂量为2 mg/kg；纳武单抗(美国百时美施贵宝公司)采用2周方案，剂量为3 mg/kg。持续用药直至出现不可耐受的不良反应或疾病明显进展，每6周进行1次用药疗效评估。在接受免疫治疗前，所有患者均进行完整的基础检查，血液检查包括血常规、肝肾功能、肿瘤标记物等，影像学检査包括MRI、CT和超声等。从影像学角度，所有患者均至少有1个可供评估的病灶。患者每3个治疗周期进行1次血液和影像学检査，评估免疫治疗疗效，观察并记录药物相关不良反应。

1.4 检测方法

在Luminex®xMAP®检测平台(美国)上，使用多重蛋白检测试剂盒Human Angiogenesis/Growth Factor Magnetic Bead Panel 1(Cat. No.HAGP1M AG-12K)(美国Bio-Rad公司)，检测17种血管生成相关生物标志物，分别是血管生成素-2(angiopoietin-2，ANG2)、骨形态生成蛋白-9(bone morphogenetic protein 9，BMP-9)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、内皮糖蛋白(endoglin)、血浆内皮素-1(endothelin-1)、纤维母细胞生长因子-1(acidic fibroblast growth factor，FGF-1)、FGF-2、卵泡抑素(follistatin)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、肝素结合表皮生长因子(heparin binding EGF-like growth factor，HB-EGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)、瘦素(leptin)、胎盘生长因子(placenta growth factor，PLGF)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)、VEGF-C、VEGF-D。

1.5 疗效评价

根据RECIST 1.1标准，接受治疗的患者疗效评价分为4级：完全缓解(complete remission，CR)、部分缓解(partial remission，PR)、疾病进展(progressive disease，PD)、疾病稳定(stable disease，SD)。其中疾病控制组(disease control，DCR)包含CR、PR和SD。

1.6 统计学方法

应用SPSS 22.0软件进行统计学分析。临床特征计数资料以例数表示，组间比较采用卡方检验；符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料采用中位数(最小值，最大值)表示，组间比较采用独立样本秩和检验。采用logistic回归分析影响晚期肺癌患者免疫治疗疗效的临床因素，结果以比值比(odds ratio，OR)及其95%可信区间(confidence interval，CI)表示，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果分析

2.1 入组NSCLC患者的临床资料分析

56例晚期NSCLC患者，经PD-1抗体免疫治疗后，根据首次疗效评价结果将患者分为疾病控制组(DCR组)和疾病进展组(PD组)，其中DCR组共34例患者(包含9例PR和25例SD)，PD组共22例患者，如表1。免疫治疗近期疗效与患者年龄、性别、ECOG评分、病理类型、临床分期、PD-1单抗类型、是否联合化疗、免疫治疗线数均无明显相关(均P>0.05)，与远处器官转移数和PD-L1蛋白表达水平明显相关(P=0.041；P=0.027)。

表1 入组NSCLC患者免疫治疗疗效与临床特征

2.2 DCR组与PD组血管生成相关生物标志物基线水平比较

将不同疗效分组的肺癌患者血管生成相关生物标志物水平进行比较，分析基线水平与免疫治疗疗效的关系，如表2。DCR组患者的基线血清HB-EGF、IL-8显著低于PD组(P=0.023，P=0.012)；DCR组患者的基线血清VEGF-D显著高于PD组(P=0.032)。两组其余血管生成相关生物标志物浓度均无显著差异(均P>0.05)。

表2 DCR组与PD组血管生成相关生物标志物基线水平比较[M(Min～Max)]

2.3 影响NSCLC患者免疫治疗疗效的临床因素logistic回归分析

Logistic回归分析结果显示，免疫治疗前血清低水平IL-8、组织PD-L1阳性表达(TPS≥1%)为NSCLC患者PD-1抗体治疗达到疾病控制的独立影响因素(OR=14.882，P=0.038；OR=16.459，P=0.011)，见表3。

表3 影响NSCLC患者免疫治疗疗效的临床因素Logistic回归分析

3 讨论

ICI的应用逐步改变了晚期肿瘤患者的治疗选择，在黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、肺癌等治疗中取得了突破性进展，显著提高了患者的5年生存期(overall survival，OS)[1-2,9]。然而，只有不到1/3的患者对免疫治疗产生反应，5%～10%患者表现出较强的毒性和副作用[10]。由于免疫治疗起效慢，且存在超进展和假性进展现象，因此，临床迫切需要寻找能够预测免疫治疗疗效的生物标志物，以便对患者进行分群，实现个体化治疗。当前有关免疫治疗的预测标志物是研究热点，其中肿瘤组织PD-L1表达水平是目前临床应用最广泛的标志物，另外MSI和TMB等指标也被写入指南和专家共识，但总体而言，预测能力有限且存在一定争议[4-5]。免疫治疗起效是一个复杂、多层次、动态的反应过程，单一的指标预测能力往往有限，需要结合肿瘤自身及微环境综合分析。本研究从血管生成相关生物标志物的角度，分析其在疾病控制组和疾病进展组中的表达水平差异，初步探索表达水平差异与免疫治疗的相关性。

TME是由一些基质细胞及细胞外基质组成的、肿瘤细胞与免疫细胞发生相互作用的场所[11]。因此，TME的特征可反映机体对肿瘤的免疫状态，可能为ICI治疗提供潜在的疗效预测标志物[12]。肿瘤的发生和发展离不开新生血管。新生血管不仅提供氧气和营养物质，清除废物，还能为肿瘤干细胞提供有利的生存环境，为肿瘤转移和免疫细胞浸润提供通道[7]。血管异常能帮助肿瘤细胞逃避免疫细胞的攻击，这些异常与血管生成相关生物标志物水平升高密切相关，如ANG2和VEGF。Wu等[13]探索了ANG2与免疫检查点治疗黑色素瘤疗效的关系，发现治疗前血浆中ANG2水平较低的患者在接受细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)/PD-L1抗体治疗时，均具有显著较长的OS。Yuan 等[14]则发现接受CTLA-4抗体治疗的晚期黑色素瘤患者中，治疗前血浆VEGF含量高的患者OS显著降低。本研究通过分析17种血管生成相关生物标志物在DCR和PD组中的表达，DCR组患者的基线血清HB-EGF、IL-8显著低于PD组，VEGF-D显著高于PD组。进一步经logistic回归分析显示，IL-8基线低水平为NSCLC患者PD-1免疫治疗达到疾病控制的独立影响因素。PD-L1表达阳性是预测免疫治疗疗效的指标，已被写入多个肿瘤治疗指南[4-5]。本研究同样证实PD-L1表达阳性是免疫治疗达到疾病控制的独立影响因素。HB-EGF被报道在多种肿瘤的诊断和预后中发挥作用，包括卵巢癌、胃癌等，提示高水平的HB-EGF与预后不良相关[15-16]。HB-EGF表达水平与免疫治疗疗效的关系尚未见报道。

IL-8是一种血管生成相关细胞因子，存在趋化因子受体1(CXC-chemokine receptor 1，CXCR1)和CXCR2两个受体。IL-8由单核细胞、内皮细胞和各种上皮细胞产生，可招募嗜中性粒细胞，刺激肿瘤增殖和血管生成[17]。Alfaro等[18]研究发现，IL-8高表达与肿瘤分期及肿瘤负荷明显相关。Hodi等[19]研究发现，采用PD-1/CTLA-4免疫联合治疗黑色素瘤患者，高IL-8与低IL-8水平患者之间的生存风险比超过3倍。IL-8水平和PD-L1表达相关性较低，IL-8对生存的影响是独立的[20]。血清IL-8水平与肿瘤组织CXCL8基因表达、嗜中性粒细胞/单核细胞计数呈明显正相关[21]。血清IL-8水平与CD8+T细胞活化标志物表达水平、T细胞浸润相关转录、干扰素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)水平负相关，提示IL-8对适应性免疫存在一定的抑制作用，影响抗原递呈效率和效应T细胞的肿瘤细胞杀伤能力[22]，而靶向IL-8可能是破解免疫治疗耐药的方法之一[23]。

本研究较系统地分析了血管生成相关生物标志物与肺癌PD-1免疫治疗疗效的相关性，找到了3个表达差异的因子，其中IL-8水平可能是NSCLC患者PD-1免疫治疗疗效相关的影响因素。本研究作为初步的探索性研究，尚存在一些不足：①疗效的评估需要参考更多指标，如ORR、无进展生存期(progression free survival，PFS)、OS等；②纳入的样本数量较少，需要在更大规模的多中心研究中验证。

为了进一步研究血管生成标志物与免疫治疗的相关性，我们接下来会做两个方面的延续工作：①除检测血管生成相关生物标志物基线水平外，在治疗的过程中动态检测，以期得到变化趋势与治疗疗效的相关性；②从分子、细胞、动物及临床病例中进一步研究IL-8预测免疫治疗疗效的分子机制；③HB-EGF、VEGF-D表达水平与免疫治疗疗效的相关性尚不明确，对于这两个有差异的分子，需要进一步挖掘其临床意义。总结而言，本文的研究结果对免疫治疗疗效预测标志物的研究提供了依据，具有一定的临床参考价值。