内蒙古部分地区草原革蜱携带无形体检测与进化分析

武 琳,祁冬冬,邢丽丽,桂 峥,于晶峰,张 雄

内蒙古地区的牧场资源丰富,畜牧业发达为蜱虫的生存提供了适宜的条件,其中草原革蜱(Dermacentornuttalli)是本区的优势蜱种之一,可携带多种病原体,在内蒙古地区已被发现的蜱传病原体有立克次体、伯氏疏螺旋体、贝氏柯克斯体以及无形体[1-4]。其中无形体属(Anaplasmaspp.)为革兰染色阴性细胞内专性寄生菌,其致病性对动物及人类健康,甚至公共卫生安全都产生了严重威胁[5]。目前在全球已确认的无形体有6种,包括嗜吞噬细胞无形体(A.phagocytophilum)、绵羊无形体(A.ovis)、山羊无形体(A.capra)、牛无形体(A.bovis)、边缘无形体(A.marginale)以及扁平无形体(A.platys)[6]。目前报道的可以感染人的无形体有噬吞噬细胞无形体,绵羊无形体变种以及山羊无形体[7-8]。其中由噬吞噬细胞无形体引起的人粒细胞无形体病(human granulocytotropic anaplasmosis,HGA)是最常见的人兽共患病,主要是由蜱虫叮咬感染后传播,侵袭人与动物中的血细胞,并以包涵体的形式在宿主动物胞浆中繁殖,使人和动物感染无形体病[9]。随着全球气候环境的改变,新发的虫媒传染病不断发生,人粒细胞无形体病的感染数量也逐年增加[10-11]。Ybañez等[12]在日本梅花鹿血液中发现了一种与嗜吞噬粒细胞无形体相关但与其不同的新物种。而近几年在我国,Kang等[13]在寄生于绵羊和牛的亚洲璃眼蜱中也发现了不同于任何无形体分类的新型菌株。内蒙古地区作为典型的自然疫源地,关于蜱虫携带无形体的遗传进化与分析相关文献不足。本研究拟对内蒙古地区草原革蜱携带的无形体进行鉴定,并对其进行系统进化分析。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂 2×San Taq PCR Mix预混液由生工生物工程(上海)股份有限公司提供,Invitrogen琼脂糖由美国Thermo Fisher Scientific公司提供,血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、通用型DNA纯化回收试剂盒、p GM-T产物克隆试剂盒、TOP10感受态细胞均由天根生化科技(北京)有限公司提供。

1.1.2 仪器 高速组织研磨仪由武汉赛维尔生物科技有限公司提供,凝胶成像系统Champ Gel5000由北京赛智创业科技有限公司提供。

1.1.3 蜱虫样本采集和鉴定 于2019年4月中旬在内蒙古自治区呼伦贝尔市(Hulun Buir)新巴尔虎右旗、赤峰市(Chifeng)阿鲁科尔沁旗天山镇巴彦温都苏木地区、鄂尔多斯市(Ordos)鄂托克前旗成川镇地区的牧场(图1),使用镊子在绵羊体表轻轻夹取蜱虫标本,然后放入收集瓶中,共采集蜱虫905只。呼伦贝尔地区共采集蜱虫292只,其中饱血蜱77只,未饱血蜱215只;赤峰地区共采集蜱虫543只,其中饱血蜱21只,未饱血蜱522只;鄂尔多斯地区采集蜱虫均为饱血蜱共70只。根据已发表文献及《蜱类学》[14-15]在解剖镜下进行蜱虫样本的形态学鉴定,然后存放于－80℃冰箱中。

图1 蜱虫样本采样地图Fig.1 Tick sampling map

1.2 蜱虫DNA提取 使用75%乙醇将所有采集到且经形态学鉴定后的蜱虫标本消毒体表,再使用生理盐水洗涤3次,最后置于滤纸上充分吸干。取同一地区同种属5～20只未饱血或1～2只饱血蜱放入无菌研磨管中,呼伦贝尔地区分为饱血蜱样本51个,未饱血蜱样本39个;赤峰地区饱血蜱样本21个,未饱血蜱样本39个;鄂尔多斯地区均为饱血蜱样本70个,将905只蜱虫共分为220个样本。在研磨管中放入1颗大磁珠和2颗小磁珠,研磨管放入适配器中(提前放入－20℃冰箱冷冻30 min),将适配器安装入研磨仪中,设置参数70 Hz,180 s。研磨后的蜱虫组织参照试剂盒说明书提取DNA,将所提取的DNA置于－20℃保存备用。

1.3 PCR扩增 首先采用巢式PCR扩增无形体16SrRNA基因进行初筛,再进一步检测部分阳性样本的MSP4基因和groEL基因。参考文献[16]合成巢式PCR的外引物Ehout-F/Ehout-R和内引物HGA-F/HGA-R,groEL基因和MSP4基因的引物则通过Oligo7软件设计,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1),PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,电泳条件为电压120 V,时间30 min。电泳结束后在凝胶成像仪的紫外灯下观察结果。实验中阴性对照为无菌蒸馏水,防止由污染造成的假阳性结果。

表1 PCR引物序列及扩增条件Tab.1 Sequences of PCR primers and amplification conditions

1.4 PCR产物测序及分析 将阳性PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。其中部分测序结果含有重叠峰,还需进行克隆测序。将两次测序结果进行序列分析。

1.4.1 PCR产物克隆测序 将需克隆测序的PCR产物的阳性条带进行切胶回收(DNA纯化回收试剂盒),将回收产物连入p GM-T克隆载体并转化至TOP10感受态细胞中,将其在含相应抗生素的LB固体培养上均匀涂开,待表面干燥后,倒置平板于37℃培养箱中培养12～16 h。挑取圆形且边缘清晰的白色菌落于含相应抗生素的LB液体培养基中,37℃摇床振荡培养过夜。取过夜培养后的菌液1 m L,送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。

1.4.2 序列分析 登录NCBI网站,将测序结果用BLAST工具与GenBank中发表的16SrRNA基因、MSP4基因、groEL基因进行同源性比对分析;使用MEGA7软件,Neighbor-Joining(NJ)法,设置Bootstrap值为1000构建系统发育进化树;DNAman7.0进行多序列比对和同源性分析。

1.5 统计学分析 不同地区间无形体感染阳性率差异采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。3个地区所检出的无形体阳性率以百分率表示,组间比较采用χ2检验,检验水准α＝0.05。

2 结 果

2.1 蜱种的形态学鉴定 对内蒙古自治区呼伦贝尔、赤峰及鄂尔多斯地区采集的905只蜱虫样本进行形态学鉴定,均具有假头基短,宽略大于长,盾板珐琅彩浓厚且色浅,刻点小且分布均匀,须肢粗短,背突直而短的特点,结果表明均为草原革蜱(图2)。

图2 草原革蜱形态学鉴定图Fig.2 Morphological identification picture of Dermacentor nuttalli

2.2 无形体PCR检测结果 经过16SrRNA基因初筛检测,结果显示在220个蜱虫混合样本中共检测到41个无形体阳性样本,均来自于单只饱血蜱样本,经Blast比对分析,与绵羊无形体同源性高达99%以上,仅有1种无形体被检测到。内蒙古地区蜱携带无形体总阳性检出率为4.53%(41/905),其中呼伦贝尔地区292只蜱虫分为90个混合样本,阳性样本有3个,阳性率为1.03%(3/292);赤峰地区543只蜱虫分为60个混合样本,阳性样本有17个,阳性率为3.13%(17/543);鄂尔多斯地区70只蜱虫分为70个混合样本,阳性样本有21个,阳性率为30%(21/70)。3个地区间无形体阳性率有统计学意义(χ2＝115.732,P＜0.05)。再对阳性样本进行检测,扩增出37个groEL基因阳性样本和41个MSP4基因阳性样本。见图3。

图3 部分蜱虫样本巢式PCR与PCR扩增产物电泳图Fig.3 Electrophoretogram of Nested PCR and PCR products of some tick samples

2.3 系统进化分析 无形体检测阳性样本结果均测序成功,在3个地区各随机选出2个无形体16S rRNA、groEL、MSP4阳性样本构建进化树,本次研究所检测到的无形体序列分别以地区命名并以几何图形在进化树上显示。本研究使用MEGA7软件构建系统发育进化树,分析结果显示:16SrRNA基因的进化树显示内蒙古地区检测出的无形体与新疆绵羊无形体xjmns03(JN400674),意大利西西里岛绵羊无形体(GQ857077)以及青海绵羊无形体海北株(CP015994)处于同一分支(图4);groEL基因的进化树显示内蒙古地区检测出的无形体与苏丹青尼罗州绵羊无形体G-BN-40(MG383903),陕西绵羊无形体Dongwangmang-goat-15(MG869402)处于同一分支(图5);MSP4基因的进化树显示内蒙古地区检测出的无形体与新疆绵羊无形体68(MN198191),陕西绵羊无形体D/SX786(MN307493),以及印度喀拉拉邦绵羊无形体(MN075143)处于同一分支(图6)。采用DNAman 7.0软件对序列进行比对分析结果显示:内蒙古地区检测出无形体16SrRNA基因序列与新疆绵羊无形体xjmns03(JN400674),意大利西西里岛绵羊无形体(GQ857077)以及青海绵羊无形体海北株(CP015994)序列同源性分别为99.49%、98.87%和98.66%;groEL基因序列与苏丹青尼罗州绵羊无形体G-BN-40(MG383903),陕西绵羊无形体Dongwangmang-goat-15(MG869402)的序列同源性分别为98.77%和96.86%;MSP4基因序列与新疆绵羊无形体68(MN198191),陕西绵羊无形体D/SX786(MN307493),以及印度喀拉拉邦绵羊无形体(MN075143)序列同源性分别为99.57%、100%和99.15%。

图4 无形体16S rRNA基因系统发育进化树Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene in Anaplasma

图5 无形体groEL基因系统发育进化树Fig.5 Phylogenetic tree of groEL gene in Anaplasma

图6 无形体MSP 4基因系统发育进化树Fig.6 Phylogenetic tree of MSP 4 gene in Anaplasma

3 讨 论

由感染嗜吞噬细胞无形体蜱虫叮咬引起的无形体病,是一种人兽共患病,除有发热、头痛、肌痛等临床症状外常伴有脏器损害[11]。2006年我国诊断出首例无形体病[17],随后在我国不同地区人群血清中发现特异性抗体,无形体病分布广泛,已成为威胁人畜健康的公共问题[18]。目前无形体的分子生物学检测被作为最常用的检测手段,可用于鉴定无形体物种的基因众多,其中16SrRNA基因在进化过程中具有高度保守性,常应用于无形体分类鉴定,但该基因对于无形体种内鉴定仍存在不足[19]。而无形体主要表面蛋白(MSPs)参与脊椎动物和无脊椎动物宿主的相互作用,可能比其他基因进化得更快,MSP4基因是MSP2蛋白超家族的一部分,对于无形体属的遗传特征的鉴别有一定的帮助[20]。gro-EL基因被Belkahia等[21]用于对南非和突尼斯地区反刍动物以及感染蜱体内分离出各种绵羊无形体菌株进行检测,且结果证明groEL基因可以更好的应用于物种划分和特异性多样性分析[22]。Selmi等[23]同时采用无形体groEL基因和MSP4基因对突尼斯地区的骆驼和蜱虫进行鉴定,证实了该地区骆驼感染了绵羊无形体。因此本研究选择16S rRNA基因、MSP4基因和groEL基因作为目的基因对内蒙古地区草原革蜱携带的无形体进行检测及分析。

在本次研究中采用巢式PCR扩增了16S rRNA基因进行无形体初筛,仅有绵羊无形体被检测到,总阳性检出率为4.53%。在呼伦贝尔、赤峰、鄂尔多斯3个地区的阳性检出率分别为1.03%、3.13%和30%,不同地区间无形体的阳性检出率差异有统计学意义(P＜0.05),鄂尔多斯地区无形体阳性检出率远高于赤峰与呼伦贝尔地区。与内蒙古本地以往的研究相比,乌兰图雅等[24]在内蒙古中西部草原革蜱体内未检测到无形体存在,其原因可能是内蒙古地区东西跨度较大,蜱虫生存环境不同,虽均在鄂尔多斯地区进行蜱样本采集,但可能因牧场和采集时间的不同,导致未能采集到感染蜱虫。而在国内的相关研究中,李红雨等[25]在新疆北疆地区蜱虫体内检测到无形体,总阳性检出率高达53.48%,可能与新疆地区的本土环境以及优势蜱种为亚洲璃眼蜱有关。本次研究通过构建16SrRNA基因、groEL基因以及MSP4基因的系统发育进化树及序列一致性分析发现:内蒙古地区16SrRNA基因的序列与新疆绵羊无形体xjmns03(JN400674),意大利西西里岛绵羊无形体(GQ857077)以及青海绵羊无形体海北株(CP015994)处于同一分支,与新疆绵羊无形体xjmns03(JN400674)同源性最高为99.49%;groEL基因序列与苏丹青尼罗州绵羊无形体G-BN-40(MG383903),陕西绵羊无形体Dongwangmanggoat-15(MG869402)处于同一分支,与苏丹青尼罗州绵羊无形体G-BN-40(MG383903)同源性最高为98.77%;MSP4基因序列与新疆绵羊无形体68(MN198191),陕西绵羊无形体D/SX786(MN307493),以及印度喀拉拉邦绵羊无形体(MN075143)处于同一分支,与陕西绵羊无形体D/SX786(MN307493)同源性最高为100%,上述结果进一步说明了本次研究检测到的无形体为绵羊无形体,且与新疆、陕西的绵羊无形体的同源性较高。早在1986年吕凤亭[26]采用光学显微镜检查血液涂片的方式在羊的血液中首次检测到了绵羊无形体,近几年研究调查中,在新疆和陕西地区蜱虫体内也检测到了绵羊无形体[27-28],内蒙古与陕西省相邻,且与新疆同属边远地区,畜牧业发达,可能发生蜱虫迁移和蜱传疾病的扩散,导致内蒙古地区无形体与新疆及陕西地区绵羊无形体同源性较高。

内蒙古地处中国北部边疆地区,畜牧业发达且拥有众多林区和牧场,为蜱虫生存创造了良好的生存环境,本次研究在内蒙古东部、北部、西部3个地区绵羊体表所采集的蜱虫样本均为草原革蜱,为内蒙古地区的优势蜱种[29]。本次研究结果显示内蒙古地区草原革蜱体内携带无形体为绵羊无形体,且与新疆和陕西地区绵羊无形体同源性较高。明确了绵羊无形体在内蒙古不同地理区域蜱虫体内的阳性率,其中鄂尔多斯地区位于内蒙古西南部,蜱携带的无形体阳性率较高,应对其进行重点监测。本研究为无形体病在内蒙古地区的防控提供了科学依据,同时也丰富了内蒙古地区草原革蜱携带绵羊无形体的数据。

(感谢呼伦贝尔市精神卫生中心的张雄教授,祁冬冬主任检验技师在现场标本采集工作中予以的大力支持和热心帮助。)

利益冲突:无

引用本文格式:武琳,祁冬冬,邢丽丽,等.内蒙古部分地区草原革蜱携带无形体检测与进化分析[J].中国人兽共患病学报,2021,37(12):1084-1090.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.159