我国结核与非结核分枝杆菌混合感染的系统性回顾及Meta分析

王瑞白,许 达,赵秀芹,万康林

非结核分枝杆菌(Non-tuberculous mycobacteria,NTM)是除结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)和麻风分枝杆菌之外的所有分枝杆菌的总称,包含有240余菌种。NTM在临床症状、影像学特征及培养条件上和结核分枝杆菌很相似,但NTM的耐药谱和结核分枝杆菌有很大差异,常规对一、二线抗结核药物天然耐药。因此,NTM感染以及其与结核的混合感染常表现为耐多药结核感染,严重增加了治疗的难度。因为人口学的变化、影像及检测技术的提高,NTM感染所致“结核病”的发病率和疾病负担在全球范围内都有所上升。在美国等国家,NTM的流行甚至超过了结核分枝杆菌。NTM的感染以及与结核分枝杆菌的混合感染已成为结核病防控不可忽视的阻力。但与结核不同,国内外对NTM都没有常规监测,NTM的流行状况基本都是通过系统性回顾研究及Meta分析获得的,更勿论其与结核的混合感染。为了解我国NTM与结核混合感染的现状及其对结核病防控的影响,我们对2020年以前的文献进行了数据提取及分析。

1 材料与方法

1.1 检索策略及文献纳入 使用“结核”和“非结核分枝杆菌/非典型分枝杆菌”以及《分枝杆菌菌种中文译名原则专家共识》(2018)中的181个非结核分枝杆菌菌种名对4个外文数据库(BIOSIS,Embase,Pub Med,Web of science)和3个中文文献数据库(知网,万方,维普)进行题名/关键词/摘要检索。

纳入标准:1)中国大陆地区的原始文献;2)受检样本为疑似或确诊结核病患者的痰液、血液、脑脊液等,或分枝杆菌培养阳性标本,有明确的临床样本量及分枝杆菌菌株总数;3)对样本同时进行了MTBC和NTM的分离鉴定。

排除标准:1)直接针对疑似或已确诊为NTM的样本的研究;2)利用已知菌种的样本进行的检测方法的研究;3)个案报道;4)同一NTM菌种引起的暴发及院内感染;5)同一地区及时间段的重复性报道仅纳入样本量最大的一例;6)综述及没有全文的会议摘要等。

1.2 数据提取、管理及分析 从文献中提取以下数据:样本的采集时间及地点、病人及样本类型、样本数量、分离鉴定方法、菌株数量(结核、NYM、混合感染)、NTM中快生及慢生菌株数量、混合感染中的菌种组成、错误鉴定菌株数。使用软件Stata 14(StataCorp,2015)和NoteExpress 3.0进行数据管理及Meta分析。异质性分析采用I2检验,森林图用于发表偏倚的定量评估,Meta分析采用的是随机模型。

2 结 果

2.1 文献检索结果 数据库中检索到1 725篇中文文献及7篇英文文献。题目及摘要筛选,去除1 369篇无关文献。对剩余的356篇文献进行全文筛选。最终纳入193篇中文文献及2篇英文文献。纳入文献涉及27个省市自治区,其中5个文献数最多的省份为广东(32篇)、江苏(25篇)、浙江(24篇)、北京(20篇)和上海(14篇)。样本最早采集时间为1988年,最长样本收集年限为13年。79篇文献检测的是痰液等初始临床样本,116篇文献直接检测的分枝杆菌培养阳性样本或分离到的分枝杆菌菌株。94.02%的文献样本收集年限大于1年,80.73%的文献检测的分枝杆菌数量大于100株(表1)。

表1 纳入文献的年限及样本量分布Tab.1 Time period and sample size of included literatures

2.2 分枝杆菌菌株分离及菌种鉴定方法 纳入文献中108篇(54.87%)使用了对硝基苯酸(P-nitrobenzene acid,PNB)和噻吩-2-羧酸联氨(thiophene-2-carboxylic acid hydrazine,TCH)鉴别培养基进行TB和NTM的区分。其中仅使用该方法的57篇,其余50篇结合了其他分子生物学的检测方法,11篇使用了2种以上的鉴定方法。88篇文献未使用PNB/TCH实验,采用分子生物学检测方法对样本进行的菌种鉴定。其中58篇使用的单一方法,29篇结合了两种以上的方法。DNA芯片和16Sr RNA等基因测序是使用频率最高的NTM菌种分子生物学鉴定方法(见表2)。

表2 纳入文献中使用的分枝杆菌鉴定方法Tab.2 Identification methods used in the included literatures

2.3 NTM的分离 对疑似/确诊结核病患者的初始样本进行检测的79篇文献中,241 188个样本中,共分离到84 639株分枝杆菌,其中NTM为9 203株。因此,在疑似/确诊结核病患者中,分枝杆菌的粗分离率为35.4%,NTM的粗分离率为5.2%,在分枝杆菌中的占比为12.7%。在直接对培阳标本进行鉴定的116篇文献中,273 504株分枝杆菌中鉴定到NTM 22 361株,NTM的占比为11.8%。两种文献类型间的NTM在分枝杆菌中的占比的差异无统计学意义,合并总效应值为12%(11.2%～12.7%)(表3)。

表3 中国大陆地区NTM及混合感染分离率及其在分枝杆菌中的占比(%)Tab.3 Isolation rates and proportions in Mycobacterium of NTM and mixed infection in mainland China(%)

纳入文献中97篇进行了NTM的菌种鉴定,其中77篇文献中慢生型NTM多于快生型NTM。在分枝杆菌中,慢生型NTM占60.77%,为我国流行的优势型。

2.4 混合感染 195篇纳入文献中有26篇报道了NTM与结核的混合感染,其中16篇是对初始临床样本的分析,10篇是对培阳样本的分析。混合感染在疑似/确诊结核病人中的分离率为0.6%(0.2%～1.1%),在 分 枝 杆 菌 中 的 占 比 为1.4%(1.1%～1.8%)(表3,图1)。在耐多药结核的1例报道中,混合感染在分枝杆菌中的占比高达24.47%[1]。HIV/AIDS合并分枝杆菌感染的2例报道中,混合感染在分枝杆菌中的占比分别为2.68%和1.03%[2-3]。

图1 混合感染meta分析森林图Fig.1 Meta-analysis of mixed infection of NTM and TB

11篇文献中进行了NTM的菌种鉴定。与TB的混合感染中胞内分枝杆菌例数最多,25例,占混合感染的26.9%。其余7种菌种分别为龟分枝杆菌(17例)、脓肿分枝杆菌(15例)、戈登分枝杆菌(11例)、偶发分枝杆菌(10例)、堪萨斯分枝杆菌(10例)、鸟分枝杆菌(4例)、蟾蜍分枝杆菌(1例)。快生型分枝杆菌共42例,慢生型51例。

仅1篇文献对NTM/TB混合感染的人群特征进行了比较分析。其中80例单一NTM感染者的年龄主要集中在20～30岁和40～60岁两组,而11例NTM/TB混合感染者在30～50岁组最多,男性感染者尤其集中于40～50岁[4]。

3 讨 论

我国NTM的流行呈现明显的波动式,20年的系统性回顾分析显示大陆地区NTM在结核疑似病例中的粗分离率为4.66%～5.78%,在分枝杆菌中的占比为11.57%[5],本次分析结果与此一致。NTM在疑似结核病患者样本中分离率不足10%,而且NTM是条件致病菌,在样本中检出NTM时分为污染、定殖和致病3种情况,NTM感染的确诊,需要对痰液等样本重复取样复检2～3次。因此,最经济高效的检测流程是先初筛,确定是否是分枝杆菌感染,是结核还是NTM,或两者的混合感染。在确定样品中存在NTM后,再进一步进行菌种鉴定。分离到菌株后,可以进行分枝杆菌菌种鉴定的方法有不下十余种,包括16S rDNA测序、特异性PCR扩增等,虽然不同方法的灵敏度和特异度不同,但这一步已不是整个流程中的瓶颈问题。因此如何确定样本中TB和NTM的存在情况是鉴定的难点。目前,我国结核病临床检验参考的依据主要包括《全国结核病细菌学检验规程》(1984版)、《结核病诊断细菌学检验规程》(中国防痨协会,1995版)及《结核病诊断实验室检验规程》(2015版),依照的也是如上的鉴定思路,即在BACTEC MGIT 960或改良罗氏培养基培养阳性后,用PNB/TCH鉴别培养基区分为人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌与NTM三类,其中人型结核PNB(－)TCH(＋),牛型结核PNB(－)TCH(－),NTM PNB(＋)TCH(＋)。之后再利用生化、16S r DNA基因测序等方法将NTM鉴定到种。该流程成本低廉,对操作要求不高,适用于基层实验室,可以解决大部分分枝杆菌的鉴定需求,在我国结核病防控工作中发挥了重要的作用。但其中的PNB/TCH存在3个主要缺陷:1)基于分枝杆菌生长的实验方法,加上之前960或罗氏培养,需要6－8周,非常耗时;2)两类分枝杆菌对PNB的敏感性不是绝对的,存在对PNB敏感的NTM菌株,也存在耐受PNB的MTBC菌株。PNB实验的错判率为10%～20%[6-7];3)不适用于混合感染,NTM在PNB/TCH上都能生长,会遮盖MTBC的结果,故而仅使用该方法的既往研究基本都是仅包含MTBC和NTM,没有混合感染的数据,这也是本次分析中195篇纳入文献中仅26篇含混合感染,1篇文献进行了人群特征分析的主要原因。而对NTM及其与结核的混合感染关注度不足,不了解实验方法的缺陷应该是其中存在的主观因素。

部分研究中用多位点基因扩增、斑点杂交、基因芯片等方法取代PNB/TCH实验,用于痰液等初始临床及培阳标本的检测,以缩短检测时间,提高检测的灵敏度和特异度。但其中仅一部分方法适用于混合型样本。如细菌鉴定中最常用,也常被视为“金标”的16S r DNA基因测序,显示的是标本中数量优势或扩增优势的菌种的结果,菌量少的菌种不能显示,而菌量近似时,测序会出现双峰。针对细菌保守基因的PCR扩增及检测,除非是菌种特异性引物,通用型引物都存在类似的问题。基因芯片、斑点杂交等是有混合感染检测能力的方法,单个使用或多个方法的联用,虽然可以实现样本的精准鉴定,但检测成本比较高,有一定的技术能力及仪器要求,不适用于基层实验室的常规检测及大规模样本分析。而且其商品化的试剂盒,鉴定范围多限于临床常见的20余种NTM菌种,文献中常见分离的NTM菌株超出试剂盒检测范围的情况,存在一定的漏诊率。因此不在于检测技术的新颖性,更适用于基层的分枝杆菌快诊新靶标的研发和推广使用是实现结核病精准诊疗,从而降低患者的诊疗负担,提高结核病终止计划实施效率的关键。

利益冲突:无

引用本文格式:王瑞白,许 达,赵秀芹,等.我国结核与非结核分枝杆菌混合感染的系统性回顾及Meta分析[J].中国人兽共患病学报,2021,37(12):1147-1151.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.161