土壤链霉菌Streptomyces ardus WS-65090产生的teleocidin类化合物及其生物活性研究

张亚妮，吴兆圆，万中义，张志刚，石丽桥，方 伟，柯少勇，王开梅

湖北省生物农药工程研究中心，武汉 430064

微生物为药物和农药的开发提供了大量的先导化合物资源。链霉菌属是放线菌的一个主要类群，链霉菌次级代谢产物结构多样，生物活性显著，被认为是许多抗生素的来源和潜在的药物来源[1]。近年来，从链霉菌中发现了一些具有良好生物活性的代谢产物，例如，阿德加霉素P(aldgamycin P)是分离自土壤链霉菌Streptomycessp.KIB-K1的新大环内脂类化合物，对金黄色葡萄球菌具有显著的抑制作用，MIC值为7.81 μg/mL[2]。化合物endostemonines A～J是首次报道的从一株内生链霉菌属的菌株BS-1 中分离鉴定出的新天然吡咯-2-羧酸酯衍生物，对棉蚜具有很强的致死活性，72 h LC50值为3.55～32.00 mg/L[3]。

在我们从放线菌中寻找活性代谢产物的过程中，发现一株土壤链霉菌StreptomycesardusWS-65090发酵提取物具有较好的杀虫活性，为了明确其活性代谢产物，对其进行了分离纯化，获得了一些teleocidin类化合物。Teleocidin最早是在1960年作为有毒物质由地中海链霉菌菌丝体的甲醇提取物中分离出来[4-6]，其拥有独特的吲哚内酰胺骨架，有A-1、A-2、B-1、B-2、B-3和B-4 6种立体构型[7,8]，因独特的结构和多样的生物活性而备受关注[9-11]。目前，已从微生物中分离出多种teleocidin结构相关的化合物，如lyngbyatoxins A～C[12,13]、olivoretins A～C[14,15]、14-O-(N-acetylglucosaminyl)teleocidin A[16]和2-oxo-teleocidin A1[17]。这些化合物表现出重要的生物活性，如皮肤刺激物、肿瘤促进剂和PKC激活剂以及细胞毒活性[12-17]。本研究报道的新teleocidin B类构型的类似物及其杀虫与细胞毒活性，丰富了此类化合物的结构类型及活性，也丰富了链霉菌活性代谢产物类型，为其在农用方面的研究提供了基础数据。

1 材料与方法

1.1 仪器

MPC 500旋光计(Waltham，USA)；岛津UV-2600 PC紫外分光度计(Shimadzu，Japan)；NICOLET IS50 FT-IR红外光谱仪(Thermo Fisher Scientific，USA)；Bruker AVANCE 700核磁共振仪(TMS为内标，德国BrukerBioSpin公司)；Jasco J-810圆二色光谱仪(日本分光公司)，Waters Xevo TQD UPLC-MS超高效液质联用(Waters Corporation,USA)；Bruker maXis Q-TOF高分辨质谱(Bruker，Germany)；Waters高效液相制备色谱仪器(Waters2525泵，带2767自动收集系统，2996二极管阵列检测器，色谱工作站Masslynx V4.0，Waters，USA)；色谱柱：Sunfire C18OBD 制备柱(19 mm×250 mm /10 mm×250 mm，5 μm，Waters，USA)。

1.2 菌株来源

菌株分离于湖北随县山坡土壤(2015年4月采样)，编号为WS-65090，在ISP-2培养基上菌落生长旺盛，28 ℃下培养14天，菌落直径7～8 mm，颜色为白色，菌落背面呈淡黄色(见图1)。气生菌丝长而直，表面光滑，孢子稀少(见图2)。将WS-65090菌株的16S rRNA序列以AB184864的登录号筛选到Gen-Bank，与ardus-NBRC 13430菌株的相似性为99.57%。通过形态鉴定和16S rRNA基因序列分析结果，将菌株WS-65090鉴定为链霉菌属StreptomycesardusWS-65090(艰难链霉菌)。菌种现保存于中国典型物保藏中心(武汉，CCTCC)，登记号为CCTCCM2020096。

图1 WS-65090菌株的平板菌落形态Fig.1 Colony morphological characteristics of strain WS-65090

图2 WS-65090菌株电镜扫描图片(Bar 2.0 μm)Fig.2 Scanning electron micrograph of strain WS-65090 (Bar 2.0 μm)

1.3 供试昆虫

草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)初孵幼虫、棉铃虫(Helicoverpaarmigera)初孵幼虫、小菜蛾(PlutellaxylostellaL.)二龄幼虫、豆蚜(Aphiscraccivora)均由湖北省生物农药工程研究中心提供。

1.4 细胞株

人肝癌细胞株HepG2、人恶性黑色素瘤细胞株A875、非洲绿猴肾细胞株Marc-145均由湖北省生物农药工程研究中心实验室常规保存培养。

1.5 培养基

发酵培养基：ISP-2液体培养基：葡萄糖4.0 g/L，麦芽提取物10.0 g/L，酵母提取物 4.0 g/L，pH值调至7.2。

1.6 菌株发酵

将S.ardusWS-65090菌株的斜面菌种接种到含有100 mL种子培养基ISP-2的500 mL锥形瓶中。在28 ℃下，以150 rpm进行振摇培养。发酵96 h后，在无菌条件下，将10%的种子培养物转移到含有100 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中，在28 ℃下，摇床上以150 rpm发酵培养120 h。

1.7 提取与分离

将链霉菌WS-65090菌株的10L发酵液冻干，用乙酸乙酯萃取冻干粉2次，合并乙酸乙酯萃取液，过滤并在真空下旋转蒸发得到粗提取物。将粗提物溶解于甲醇、离心，采用反相制备液相色谱进行分离纯化，色谱柱为Waters Sunfire prep C18OBD柱(19 mm×250 mm，5 μm)；乙腈(B)和水(A)为流动相，以24 mL/min的流速梯度洗脱(0～2 min，5%B；2～27 min，5%→100% B；27～32 min，100%B；32～37 min，100%→5%B；37～40 min，5%B)，采用PDA 全波长扫描，收集得到13个组分(Fr1～Fr13)。其中，组分Fr4～13对草地贪夜蛾、棉铃虫、小菜蛾和蚜虫具有较强的毒杀活性，采用反相制备液相色谱分别对组分Fr4～13进行进一步分离纯化，色谱柱为Waters Sunfire prep C18OBD柱(19 mm×250 mm，5 μm)；乙腈(B)和水(A)为流动相，以24 mL/min的流速梯度洗脱(0～2 min，20%B；2～22 min，20%→100%B；22～26 min，100%B；26～30 min，100%→20%B；30～33 min，20%B)。采用PDA全波长扫描，由Fr11分离到了化合物1(19.08 mg)，由Fr12获得了化合物2(10.96 mg)，由Fr7获得了化合物3(28.70 mg)，由Fr8获得化合物4(16.93 mg)，从Fr5获得化合物5(10.33 mg)。

1.8 杀虫活性测定

采用24孔微量盘人工饲料表面涂布法测定了化合物1～5对草地贪夜蛾、棉铃虫和小菜蛾幼虫的杀虫活性。首先将每种化合物溶解在甲醇中，并用含0.1%吐温-80的水稀释至0.25、0.125、0.63、0.031、0.016 mg/mL。将40 μL样品溶液转移到24孔微量盘人工饲料表面。然后，将10只幼虫放入孔中，在25 ℃下培养。每一种浓度使用30只幼虫(每孔10只幼虫)。72 h后，与85%阿维菌素阳性对照组和阴性空白对照组比较，目测死亡率，计算致死浓度50%值(LC50)。

化合物1～5对蚜虫的杀虫活性采用浸渍法[18]。每一种化合物用0.1%吐温-80乙醇溶液制备成5种浓度梯度(0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/mL)。在实验室条件下，将带蚜虫大豆幼苗浸入不同浓度的供试样品溶液5 s，吸取多余的溶液，然后置于室温培养。每种处理重复3次，72 h后，与阴性对照组和85%阿维菌素阳性对照组比较，观察死亡率。然后计算致死浓度50%值(LC50)。

1.9 体外细胞毒活性测定

化合物1～5对HepG2、A875和Marc-145 3种细胞系的体外细胞毒活性采用MTT法[19]。实验重复3次，用统计软件SPSS16.0进行数据分析并计算样品的半数抑制浓度(IC50)。

2 结果与分析

2.1 化合物结构鉴定

表1 化合物1和2的1H NMR(700 MHz)和13C NMR(175 MHz)数据(CDCl3)

图3 化合物1～5的化学结构Fig.3 Structures of compounds 1-5

图4 化合物1和2的HMBC和1H-1H COSY相关信号Fig.4 1H-1H COSY and HMBC correlations of compounds 1 and 2

虽然化合物1和2具有相同的平面结构，且CD谱表明两者在220～340 nm呈现相似的科顿效应(见图5)，但它们的一些核磁共振数据却有很大不同，表明它们是立体异构体。化合物1和2在二维NOESY谱中并未表现出明显的相关，根据1和3，2和4的1H和13C NMR中化学位移的相似性，推测1的立体中心的相对构型与3相同，2与4相同。由于未能成功获得化合物1和2的晶体，通过化学方法碱水解实验进一步确定1和2的绝对构型。分别用相同质量的0.1 N氢氧化钠溶液水解化合物1和2[21]，应用UPLC-MS将它们的水解产物分别与共同分离的化合物teleocidin B-2(3)、B-3(4)进行比较分析，通过比较其紫外吸收光谱、分子离子、色谱数据及CD谱(补充数据)，确认化合物1和2的水解产物分别为化合物teleocidin B-2、B-3，而teleocidin B-2、B-3的立体构型早在20世纪80年代通过X-Ray确定[8]。因此，1与teleocidin B-2(3)具有相同的立体结构，为9S，12S，19R，22S；2与teleocidin B-3(4)具有相同的立体结构，为9S，12S，19S，22S。

图5 化合物1～4的CD谱Fig.5 CD spectrum of compounds 1-4

化合物3白色无定形固体；ESI-MS：m/z452.73 [M+H]+,450.77 [M-H]-；1H NMR(700 MHz，CDCl3)δ：8.20(1H，br s，H-1)，6.81(1H，br s，H-2)，6.55(1H，s，H-5)，6.12(1H，dd，J= 17.5，10.4 Hz，H-28)，5.18(1H，dd，J= 10.5，1.4 Hz，H-29)，5.10(1H，dd，J= 17.4，1.3 Hz，H-29)，4.35(1H，d，J= 10.2 Hz，H-12)，4.34(1H，m，H-9)，3.74(1H，dd，J= 11.4，3.8 Hz，H-8)，3.54(1H，dd，J= 11.4，8.5 Hz，H-14)，3.16(1H，d，J= 17.3 Hz，H-8)，3.00(1H，dd，J= 17.3，3.9 Hz，H-8)，2.93(3H，s，H-18)，2.62(1H，m，H-15)，2.11(1H，m，H-24)，1.90～1.82(2H，m，H-20)，1.88～1.62(2H，m，H-21)，1.48(3H，s，H-27)，1.32(3H，s，H-23)，0.98(3H，d，J=6.8 Hz,H-25)，0.93(3H，d,J=6.3 Hz，H-17)，0.70(3H，d，J=6.7 Hz,H-16)，0.60(3H，d，J=6.9 Hz,H-26)；13C NMR(175 MHz，CDCl3)δ：174.4(C-11)，148.5(C-28)，145.9(C-4)，140.0(C-7a)，137.8(C-6)，120.8(C-2)，117.6(C-7)，117.2(C-3a)，113.9(C-3)，113.1(C-29)，107.0(C-5)，71.1(C-12)，65.3(C-14)，56.1(C-9)，40.4(C-19)，39.8(C-22)，38.4(C-24)，35.8(C-21)，34.0(C-8)，33.3(C-18)，28.6(C-15)，28.1(C-23)，26.9(C-20)，25.6(C-27)，21.9(C-17)，19.8(C-16)，18.9(C-26)，17.8(C-25)。以上数据与文献[8,22]基本一致，故化合物3鉴定为teleocidin B-2。

化合物4白色无定形固体；ESI-MS：m/z452.73 [M+H]+，450.86 [M-H]-。1H NMR(700 MHz，CDCl3)δ：8.46(1H，br s，H-1)，6.76(1H，br s，H-2)，6.47(1H，s，H-5)，6.22(1H，dd，J= 17.7，10.6 Hz，H-28)，5.38(1H，dd，J= 17.7，1.2 Hz，H-29)，5.25(1H，dd，J= 10.6，1.2 Hz，H-29)，4.35(1H，m，H-9)，4.29(1H，d，J= 10.2 Hz，H-12)，3.76(1H，dd，J= 11.4，3.7 Hz，H-14)，3.57(1H，dd，J= 11.4，8.5 Hz，H-14)，3.13(1H，d，J= 17.1 Hz，H-8)，2.98(1H，dd，J= 17.4，3.7 Hz，H-8)，2.90(3H，s，H-18)，2.60(1H，m，H-15)，2.27(1H，m，H-24)，1.94～1.42(2H，m，H-20)，1.94～1.42(2H，m，H-21)，1.47(3H，s，H-27)，1.31(3H，s，H-23)，1.02(3H，d,J=6.8 Hz，H-25)，0.92(3H，d，J=6.3 Hz,H-17)，0.65(3H，d，J=6.8 Hz,H-16)，0.63(3H，d,J=6.8 Hz，H-26)；13C NMR(175 MHz，CDCl3)δ：174.6(C-11)，151.9(C-28)，146.0(C-4)，138.6(C-7a)，137.5(C-6)，120.3(C-2)，118.3(C-7)，116.8(C-3a)，113.7(C-3)，111.4(C-29)，106.7(C-5)，71.0(C-12)，65.5(C-14)，56.0(C-9)，39.8(C-19)，39.6(C-22)，37.2(C-24)，34.9(C-21)，33.9(C-8)，33.4(C-18)，30.1(C-23)，28.7(C-15)，25.1(C-20)，21.9(C-17)，21.8(C-27)，19.5(C-16)，18.6(C-26)，17.2(C-25)。以上数据与文献[8,22]基本一致，故化合物4鉴定为teleocidin B-3。

化合物5白色无定形固体；ESI-MS：m/z438.73 [M+H]+，436.68 [M-H]-。1H NMR(700 MHz，CDCl3)δ：8.53(br s，1H，H-1)，6.97(d，J= 8.1 Hz，1H，H-6)，6.82(br s，1H，H-2)，6.48(d，J= 8.1 Hz，1H，H-5)，6.20(dd，J=17.7，10.6 Hz，1H，H-21)，5.30(d，J= 19.0 Hz，1H，H-22)，5.26(d，J= 10.7 Hz，1H，H-22)，5.09～5.06(m，1H，H-25)，4.34(d，J= 10.0 Hz，1H，H-12)，4.33(br s，1H，H-9)，3.74(dd，J= 11.3，4.1 Hz，1H，H-14)，3.55(dd，J= 11.3，8.5 Hz，1H，H-14)，3.15(br d，J= 17.2 Hz，1H，H-8)，3.02(dd，J= 17.3，3.6 Hz，1H，H-8)，2.91(s，3H，H-18)，2.59(m，1H，H-15)，1.99～1.81(m，2H，H-23)，1.96～1.89(m，2H，H-24)，1.63(s，3H，H-28)，1.45(s，3H，H-20)，1.39(s，3H，H-27)，0.91(d，J= 6.3 Hz，3H，H-16)，0.60(d，J= 6.7 Hz，3H，H-17)；13C NMR(175 MHz，CDCl3)δ：174.3(C-11)，149.2(C-21)，146.7(C-4)，137.7(C-7a)，131.7(C-26)，124.8(C-25)，121.3(C-2)，120.6(C-6)，120.3(C-3)，118.7(C-7)，114.1(C-3a)，112.4(C-22)，106.2(C-5)，71.3(C-12)，65.4(C-14)，55.8(C-9)，43.6(C-19)，38.2(C-23)，34.3(C-8)，33.2(C-18)，28.8(C-15)，25.9(C-27)，25.0(C-20)，23.4(C-24)，21.8(C-16)，19.6(C-17)，17.6(C-28)。以上数据与文献[7,23,24]基本一致，故化合物5鉴定为teleocidin A-2。

2.2 化合物活性测试结果

2.2.1 杀虫活性测试结果

化合物1～5对草地贪夜蛾、棉铃虫和小菜蛾幼虫的活性测定，采用24孔盘人工饲料表面涂布法，对蚜虫的测定采用浸渍法。72 h杀虫活性结果如表2所示，化合物1对草地贪夜蛾、棉铃虫、小菜蛾这3种供试昆虫的活性是这5个化合物中表现最强的，其LC50值分别为42.6、36.5、66.4 μg/mL；其次为化合物2，LC50值分别为44.8、44.2、68.1 μg/mL；化合物3～5对这3种供试昆虫的LC50值为76.6～168.3 μg/mL。这5个化合物对蚜虫表现出中等的杀虫活性，其LC50值为144.5～206.8 μg/mL。而阳性对照阿维菌素对这4种供试昆虫的活性均高于化合物1～5，其LC50值分别为2.2、1.9、3.1、1.7 μg/mL。

表2 化合物1～5对4种供试昆虫的杀虫活性

2.2.2 体外细胞毒活性

化合物1～5的细胞毒活性测试采用MTT法。结果表明，与阳性对照5-氟尿嘧啶相比，这些化合物的细胞毒活性较强，对A875、HepG2和Marc-145细胞系的IC50值为3.08 ± 1.04～18.40 ± 2.06 μM(表3)。具体而言，1对这3种细胞系表现出细胞毒活性的IC50值分别为15.53 ± 2.53、4.64 ± 0.95、13.52 ± 2.88 μM；2对这3种细胞系的IC50值为11.72 ± 1.42、5.29 ± 1.95、13.86 ± 3.16 μM，与化合物3～5相比，显示出近似的细胞毒活性。

表3 化合物1～5对A875、HepG2和Marc-145细胞系的体外细胞毒活性

3 结论

从链霉菌StreptomycesardusWS-65090发酵提取物中分离得到5个teleocidin类化合物，这些化合物均具有杀虫和细胞毒活性。其中14-O-acetylteleocidin B-2(1)是一种新的化合物，14-O-acetylteleocidin B-3(2)是一种新的天然产物，首次对其核磁共振波谱数据进行了详细阐述。这也是近年来首次从土壤来源的链霉菌菌株中分离出的teleocidin B类型结构的化合物，其对草地贪夜蛾、棉铃虫、小菜蛾和蚜虫具有杀虫活性。另外，这两种新的teleocidin类似物在C-14处含有乙酰基，其杀虫活性强于已知的三种化合物。结合细胞毒活性的实验结果，说明了teleocidin类似物的C-14位的乙酰基基团对其生物活性有重要影响。Teleocidin类化合物生物活性多集中在医用活性方面，本研究报道的化合物丰富了teleocidin类化合物的种类，扩展了生物活性，为其在农用方面的研究提供了探讨。