UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术快速鉴定木芙蓉花化学成分

王 艺，冯丽萍，黄李璐，胡 攀，严 鑫，王 希，郑 雨，夏厚林*

1成都中医药大学药学院，成都 611137；2成都市中草药研究所，成都 610016；3成都市植物园，成都 610083

木芙蓉花，为锦葵科木槿属植物木芙蓉HibiscusmutabilisL.的干燥花，《本草纲目》云：“此花艳如荷花，故有芙蓉、木莲之名……”[1]，又有华木、拒霜、霜降花等多个称谓。味微辛、性凉，归肺、肝经，有清肺凉血，散热解毒，消肿排脓之效，临床上多用于治疗肺热咳嗽、瘰疬、肠痈、白带等，外用还可用于治疗痈疖脓肿、脓耳、无名肿毒、烧烫伤等，收载于2019版《广东省中药材标准第三册》[2]。

四川成都自古以来盛栽芙蓉，芙蓉花从1983年开始被定为成都市“市花”，是天府文化的重要组成元素，它不仅是城市地域人文特征的浓缩和象征，更是城市形象的重要标志和特色名片。除了人文方面的深厚积淀，木芙蓉也是兼具营养价值和药用价值的药食同源性中药，现代药理研究表明其具有抗过敏[3]、降低血糖[4]等作用并对溶血性链球菌有较强抑制作用[2]，其提取物也被广泛应用于化妆品[5]和食品的原料或添加品[6]等方面。但由于目前国内外关于木芙蓉花化学成分的报道相对较少、相关药理研究多以粗提物为研究对象、药效物质基础的发现与作用机制的阐述不够深入等因素，其临床应用相对较少，范围局限，仅在治疗痈肿[7]和炎症[8]等方面有相关报道，不仅影响木芙蓉花在医药基础研究与临床应用上的发现与拓展，也是其在食品、化妆品等应用领域发展的瓶颈，故明确木芙蓉花的物质基础并开展相关的药效学研究对其应用和开发有着重要意义。超高效液相色谱串联四极杆静电场轨道阱质谱技术是近几年发展起来的新型液质联用技术，具有分辨率高、质量精度好、定性和定量能力强等特点，在中药分析领域也展现出了极大的应用前景。因此为了进一步了解木芙蓉花的化学成分，本实验采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS对其进行化学分析，以期对木芙蓉花的物质基础做出阐述。

1 材料

Vanquish 型超高效液相色谱联用Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；KQ-600DE型超声波清洗器(频率40 kHz，功率600 W，昆山市超声仪器有限公司)，Discovery DV215CD型十万分之一电子天平(美国Ohaus Corporation公司)；BS124S型万分之一析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

对照品盐酸黄连碱(中国食品药品检定研究院，批号112026-201601)；L-苯丙氨酸、芦丁、金丝桃苷、椴树苷(成都克洛玛生物科技有限公司，批号分别为CHB180328、CHB190110、CHB171010、CHB180214)；水杨酸、槲皮素、山奈酚(成都埃法生物科技有限公司，批号分别为AF9070721、AF20032451、AF20050953)；异槲皮苷、原儿茶酸(四川省维克奇生物科技有限公司，批号分别为wkq20060104、wkq16012105)；甜菜碱(成都得思特生物技术有限公司，批号DSTDT001202)；腺苷(英国PureChemLand公司，批号PCL-#-Ad559)，以上对照品纯度均>98%。色谱乙腈(美国Fisher公司)，色谱甲醇(美国TIDIA公司)，水为超纯水，乙醇为分析纯。

木芙蓉花样品于2019年10月中旬采集于四川省成都市三合镇木芙蓉花种植基地，自然阴干。经成都中医药大学药学院龙飞副教授鉴定为木芙蓉HibiscusmutabilisL.的干燥花。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流动相：流动相0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脱(0～4 min，95%→90%A；4～10 min，90%→55%A；10～18 min，55%→5%A；18～20 min，5%A)；流速：0.3 mL/min，柱温25 ℃，进样量：3 μL。

2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)，扫描方式：正负离子同时扫描，喷雾电压：3.5 kV；鞘气流速：35 psi；辅助气流速：10 psi；毛细管温度：320 ℃，探头加温器温度：350 ℃；最大喷雾电流：100 A；S-Lens分辨率：50。扫描模式为全扫描/数据依赖二级扫描(Full MS/dd-MS2)，一级分辨率70 000，二级分辨率17 500，扫描范围m/z100～1 500。

2.3 对照品溶液的制备

分别称取甜菜碱、腺苷、苯丙氨酸、原儿茶酸、金丝桃苷、异槲皮苷、水杨酸、芦丁、椴树苷、槲皮素、小檗碱、山奈酚适量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制得浓度分别为25 μg/mL混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

称取芙蓉花粉末5.0 g，加入90%乙醇25 mL进行回流提取两次，每次2 h，过滤，合并滤液，过0.22 μm微孔滤膜即得。

3 结果与分析

按“2.1”“2.2”项下条件对木芙蓉花供试品溶液进行UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析，分别得到正负离子模式下的总离子流图(见图1、2)。根据得到的高分辨精确化合物分子量，通过Thermo Xcalibur软件筛选出实测相对分子量与理论相对分子量差值小于5 ppm的化合物，并计算其可能的元素组成。结合mz Cloud、mz Vault、ChemSpide、Pubchem等数据库进行匹配，参考相关文献信息及与对照品比对等方式，最终从木芙蓉花中鉴别出54个化学成分，质谱信息和结构见表1和图3。54个成分中黄酮及其苷类成分25个，有机酸类14个，香豆素类成分4个，氨基酸类2个，核苷类2个，生物碱类2个，其他类5个，其中12个化合物经过对照品比对后得到明确标识。

图1 木芙蓉花90%乙醇提取物的UPLC-Q-Orbitrap HRMS正离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of 90% ethanol extract of Hibiscus mutabilis flowers by UPLC-Q-Orbitrap HRMS in positive ion mode

图2 木芙蓉花90%乙醇提取物的UPLC-Q-Orbitrap HRMS负离子流图Fig.2 Total ion chromatogram of 90% ethanol extract of Hibiscus mutabilis flowers by UPLC-Q-Orbitrap HRMS in negative ion mode

图3 木芙蓉花化合物的结构Fig.3 Compounds structures of Hibiscus mutabilis flowers

3.1 黄酮类及其苷类化合物鉴定

黄酮及其苷类成分为木芙蓉花的主要化学成分，本实验从木芙蓉花中鉴定了黄酮醇(峰34、42、46)，以槲皮素、山奈酚、异鼠李素等为母核黄酮苷(峰20、21、24、25、27～29、31～33、35、39～41、43)，二氢黄酮(峰25、36、45)，黄酮(峰30、50、51)，异黄酮类(峰49)化合物共25个。

黄酮醇糖苷类化合物易发生糖苷键断裂，丢失葡萄糖残基、鼠李糖残基或是木糖残基等碎片后形成黄酮醇苷元，而后苷元可继续丢失CO2、H2O等碎片离子或是发生逆狄尔斯-阿尔德(RDA)裂解，形成[1,3A]-、[1,4A]-、[1,3B]-、[1,4B]-等特征碎片离子[9]。例如化合物27在ESI-模式下的准分子离子峰m/z433.077 58，在二级质谱中，丢失了阿拉伯糖残基形成槲皮素特征离子m/z301.035 03、300.027 31，苷元离子脱去H2O、CO等中性碎片形成碎片离子m/z283.024 57、271.024 63、255.029 65、227.034 81；或者发生RDA裂解，脱去C8H6O3，生成特征碎片离子m/z151.002 85[1,3A]-。根据文献信息[10]比对，推测该化合物可能为番石榴苷；化合物46在ESI-模式下的准分子离子峰m/z285.040 19，脱去CO、H2O、CO2后形成二级碎片离子m/z257.044 59、239.034 65、229.050 40、211.039 08；或是C4-C10键断裂形成碎片m/z243.028 61。根据文献信息[11]及与对照品比对，确定该化合物为山奈酚，裂解途径见图4。

图4 山奈酚的质谱裂解途径Fig.4 Fragmentation pathway of kaempferol

黄酮、异黄酮类化合物二级质谱裂解过程中易丢失CO、CO2等，邻位羟基取代还易失去H2O，若有甲氧基取代的时候，则优先连续丢失CH3，然后丢失CO。例如化合物50在ESI-模式下的准分子离子峰m/z373.092 62，二级质谱产生的碎片离子m/z358.069 27、343.045 75、328.022 28、300.027 19、285.003 94、257.009 09、229.013 26。根据数据库检索及与文献信息[12]比对，确定该化合物为蔓荆子黄素。

二氢黄酮类化合物易丢失H2O、CO等中性碎片离子或是发生RDA裂解。例如化合物26在ESI-模式下的准分子离子峰m/z303.144 81，脱去H2O、CO2后形成二级质谱产生的碎片离子m/z285.040 31、259.061 61、241.049 67；或发生RDA裂解生成[1,4A]-、[1,4B]-特征碎片离子m/z178.997 74和m/z124.015 70。根据数据库检索及与文献信息[10]对比，确定该化合物为二氢槲皮素。

3.2 有机酸类成分

从木芙蓉花中共鉴别有机酸类成分14个(峰2、6、7、9、11、12、15、16、18、19、23、37、38、48)，二级质谱裂解特征通常易失去H2O、CO、CO2、CH2等中性碎片且大多在负离子模式下有较好响应。化合物38在ESI-模式下的准分子离子峰为m/z137.023 50，二级质谱产生的碎片离子m/z93.033 54。根据文献信息[13]及与对照品比对，确定化合物为水杨酸，裂解途径见图5。

图5 水杨酸的质谱裂解途径Fig.5 Fragmentation pathway of salicylic acid

3.3 香豆素类成分

从木芙蓉花中共鉴别香豆素类成分4个(峰13、14、17、47)，其二级质谱裂解过程中易丢失CO、H2O、CH3等中性分子，化合物13在ESI+模式下的准分子离子峰m/z193.049 47，二级质谱产生的碎片离子m/z178.026 02、165.054 75、133.028 38。根据数据库检索及与文献信息[14]比对，确定化合物为东莨菪内酯，裂解途径见图6。

图6 东莨菪内酯的质谱裂解途径Fig.6 Fragmentation pathway of scopoletin

3.4 核苷类成分

从木芙蓉花中共鉴别2个核苷类成分(峰4、8)，化合物4在ESI+模式下的准离子峰为m/z268.103 94，在二级质谱中，丢失一分子呋喃核糖残基形成m/z136.061 68碎片离子。根据文献信息[15]及与对照品比对，确定该化合物为腺苷，裂解途径见图7。

图7 腺苷的质谱裂解途径Fig.7 Fragmentation pathway of adenosine

3.5 氨基酸类成分

从木芙蓉花中共鉴别2个氨基酸类成分(峰7、12)，二级质谱裂解特征通常为连续丢失NH3、H2O、HCOOH等碎片，化合物10在ESI+模式下的准分子离子峰为m/z166.086 07，二级质谱产生的碎片离子有m/z149.059 62、131.049 18、120.080 87、103.054 54。根据文献信息[16]及与对照品比对，确定该化合物为L-苯丙氨酸，裂解途径见图8。

图8 L-苯丙氨酸的质谱裂解途径Fig.8 Fragmentation pathway of L-phenylalanine

3.6 生物碱类成分

从木芙蓉花中共鉴别2个生物碱类成分(峰1、44)，化合物1在ESI+模式下的准分子离子峰为m/z118.086 45，丢失一分子CH2和COOH后形成二级碎片离子m/z59.073 62。根据文献信息[17]及与对照品比对，确定该化合物为甜菜碱，裂解途径见图9。

图9 甜菜碱的质谱裂解途径Fig.9 Fragmentation pathway of betaine

3.7 其他类

从木芙蓉花中共鉴别5个其他类成分(峰3、22、52、53、54)，化合物3在ESI-离子模式下的准分子离子峰为m/z341.109 86，二级质谱产生的碎片离子有m/z179.055 25、161.044 68、119.034 12。根据数据库检索及与文献信息[14]比对，确定该化合物为蔗糖。

4 讨论与结论

近年来，UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术以其高分辨率、高质量精度、定性定量快速准确等优点广泛应用于中药化学成分分析及复杂多成分质量控制等领域。本实验选用0.1%甲酸水-乙腈为流动相对木芙蓉花化学成分进行梯度洗脱，为更好的探究木芙蓉花的化学成分，选用正、负两种离子扫描方式进行数据采集。根据现有文献报道的保留时间、相对分子量、准分子离子峰、二级质谱碎片离子，结合二级质谱裂解规律以及化学对照品质谱信息等，对各质谱峰进行归属分析，从木芙蓉花乙醇提取液中共检测到7类成分(黄酮及其苷类、有机酸类、香豆素类、氨基酸类、核苷类、生物碱类等)，共54个化合物。结合文献以及scifinder数据库发现其中33个成分首次在木芙蓉中报道，11个成分首次在木槿属中报道。在花中新发现的11个黄酮类成分，例如广寄生苷和番石榴苷通过降低游离脂肪酸的释放[18]、柚皮素-7-O-葡萄糖苷通过激活PPARγ受体和磷酸化PI3K/AKT信号通路表现出降糖作用[19]；蔓荆子黄素可通过下调PI3K/Akt信号通路抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭[20]、与微管蛋白结合来促使MCF7乳腺癌细胞G2/M期阻滞[21]，广寄生苷、野鸢尾黄素通过抑制PI3K/AKT信号通路[22]、ROS介导的线粒体功能性障碍[23]来诱导MDA-MB-231细胞凋亡；樱桃苷对中波紫外线(UVB)导致的人角质细胞(HaCaT)损伤[24]有修复作用等，对于木芙蓉花临床应用的拓展具有一定的意义。从构效关系来看，黄酮类成分的抗肿瘤、抗炎等多种药理活性主要受羟基化程度、C2-3位双键、糖基以及母核结构的影响，木芙蓉花黄酮种类众多，结构多样性强，具有生物活性多样性。本文完善了木芙蓉的化学成分库，为后续木芙蓉花的开发利用、药效物质基础研究、质量控制等提供了依据。

木芙蓉是一种常用中药，木芙蓉叶收载于2020版《中国药典》[25]，且叶和花均可以入药。本实验与已报道的木芙蓉叶[11]化学成分对比，相同的黄酮类成分有14个，有机酸和香豆素类成分5个，体现了同一药用植物不同部位中的化学成分具有一定的相似性。此外，木芙蓉花中某些已知成分未在此次分析中检测到，可能与ESI的离子化效率有关；同分异构体化合物的鉴定一直以来都是质谱分析中的难点，因此仅通过质谱来进行指认具有一定的局限性，需要核磁共振等波谱分析进一步确认。通过观察总离子流图，可以发现在保留时间11～17 min鉴别出化合物较少，因此为了进一步了解该段化合物的组成，我们可以采用不同极性溶剂对其进行部位萃取，通过用相同高效液相色谱条件进行色谱峰分析，寻找其可能存在的极性部位，这也可为我们后续对木芙蓉花进行以化合物分离为手段的物质基础研究起到一定指示作用。