基于门诊患者阴道微生态与HPV 感染的相关性研究

程倩倩，宋殿荣，王雅楠，郭洁，赵琳，陈秀杰，张倩玉，王嫱

阴道是一个开放性的自然腔道，极易受外界环境和内在因素侵扰，一旦阴道微生态的动态平衡被打破，容易引发各类阴道感染。女性宫颈暴露于阴道内，越来越多的证据表明阴道微生态变化及其导致的阴道感染与宫颈人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染明显相关[1-2]。而宫颈HPV 感染又是宫颈癌及癌前病变——宫颈上皮内瘤变（CIN）发生的必要条件[3]。近年来，宫颈癌发病率呈增长趋势，且日趋年轻化，严重威胁到妇女的健康和生命。本研究通过分析以外阴阴道瘙痒、干涩、疼痛和（或）分泌物异常为主诉就诊患者的阴道微生态和宫颈HPV 检测结果，探讨阴道微生态状况与HPV 感染的相关性，为HPV 感染、宫颈病变的防治提供新策略。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2019年2 月1 日—2019年12 月31日因外阴阴道瘙痒、干涩、疼痛和（或）分泌物异常就诊于天津中医药大学第二附属医院妇科门诊的患者，同时进行阴道微生态和宫颈HPV 检测。纳入标准：年龄≥25 岁；有性生活史；就诊前1 天内无性生活及阴道灌洗；就诊前3 d 内无局部或全身抗生素用药；知情同意。排除妊娠期、哺乳期、月经期、阴道出血或合并其他急性生殖器感染性疾病或泌尿系感染性疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 ①阴道微生态标本取样：无菌阴道棉拭子旋转蘸取阴道侧壁上1/3 处分泌物，并在清洁载玻片上均匀涂抹；另取一支无菌阴道棉拭子，于相同部位刮取阴道分泌物。②宫颈HPV 标本取样：擦拭去除宫颈黏液，使用一次性宫颈刷置于宫颈管外口处，旋转5 周刷去宫颈脱落细胞，洗脱于液基细胞保存液中送检。

1.2.2 阴道微生态检测 形态学检测：将阴道分泌物涂片，干燥、固定后，行革兰染色，在油镜（OLYMPUS CX23 显微镜）下检查阴道菌群，观察菌群密集度、多样性、优势菌、病原微生物和各项疾病评分等形态学指标；功能学检测：用留取阴道分泌物的湿棉签，采用安图生物阴道炎五联检试剂盒Ⅱ（干化学酶法）在Autowo Mo 全自动生殖道分泌物工作站（嘉兴凯实生物科技有限公司生产）上，检测需氧菌、厌氧菌、真菌、滴虫等阴道微生物的代谢产物、酶的活性及pH 值。

1.2.3 阴道微生态相关指标判定标准 参照中华医学会妇产科学分会感染性疾病协作组制定的《阴道微生态评价的临床应用专家共识》[4]。正常阴道微生态的定义为：阴道菌群的密集度为Ⅱ～Ⅲ级、多样性为Ⅱ～Ⅲ级、优势菌为乳杆菌、阴道pH 值为3.8～4.5、乳杆菌功能正常（H2O2分泌正常）和白细胞酯酶等阴性。当阴道菌群的密集度、多样性、优势菌和阴道分泌物白细胞计数等炎症反应指标及pH 值和乳杆菌功能任何1 项出现异常，即诊断为微生态失调状态。当镜检发现芽生孢子或假菌丝时，诊断外阴阴道假丝酵母菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）；镜检发现滴虫，诊断滴虫阴道炎（trichomonal vaginitis，TV）；Nugent 评分4～6 分，诊断细菌性阴道病（bacterial vaginosis，BV）中间型；≥7 分，诊断BV；Donders 评分≥3 分，诊断需氧菌性阴道炎（aerobic vaginitis，AV）。若阴道微生态形态学和功能学指标出现异常，但不符合上述VVC、TV、BV、BV 中间型和AV 诊断者，则诊断为无明确致病菌的微生态失调。

1.2.4 宫颈HPV 分型 使用凯普HBNP-4801A 全自动提取仪，用凯普核酸提取试剂盒（DNA-L型磁珠法）提取宫颈细胞DNA，然后使用上海宏石SLAN-965 荧光核酸扩增仪，采用凯普荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法进行HPV 分型检测。HPV 分型检测试剂盒可检测23 种HPV 亚型，包括14 种高危亚型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）、6 种低危亚型（HPV6、11、42、43、44、81）和3 种疑似高危亚型（HPV53、73、82）。

1.3 统计学方法将获得的临床资料整理、核对无误后录入Microsoft Excel。采用SPSS 21.0 统计学软件对数据进行分析。定性资料用例（百分比）表示，组间比较釆用χ2检验或Fisher确切概率法。多因素分析采用Logistic 回归分析，计算OR 值及95%CI。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阴道微生态的形态学分析符合纳入标准的患者共483 例，年龄25～87 岁，平均（37.99±19.42）岁。阴道微生态正常者4 例，占0.8%，微生态失调者479 例，占99.2%，其中，有明确致病菌的微生态失调（即阴道感染）350 例（73.1%），无明确致病菌的微生态失调129 例（26.9%）。在350 例阴道感染患者中，单一感染287 例（82.0%），混合感染63 例（18.0%）。单一感染中发生频次由高到低依次为VVC、BV、BV中间型、AV 和TV，混合感染中发生频次由高到低依次为BV 中间型+VVC、BV+VVC、BV+TV、AV+TV、BV+AV、BV+AV+TV，VVC 在混合感染中发生率最高，占79.4%（50/63），其次依次为BV [49.2%（31/63）]、BV 中间型[42.9%（27/63）]、TV[19.0%（12/63）]和AV[11.1%（7/63）]。见表1。

表1 阴道感染的分类及分布情况

2.2 阴道微生态的功能学分析阴道感染者中乳杆菌减少者、H2O2含量减少者占比高于无明确致病菌的微生态失调者（均P＜0.05）；但2 组的白细胞异常增多者占比差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。混合感染者中H2O2含量减少者、白细胞异常增多者占比高于单一感染者（均P＜0.05）；但2 组的乳杆菌减少者占比差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。各种具体感染类型的单一感染者中乳杆菌减少者、H2O2含量减少者及白细胞增多者占比差异有统计学意义（均P＜0.05）；其中BV、TV 乳杆菌减少者、H2O2含量减少者占比均为100%；在白细胞数量方面，AV、VVC 患者的白细胞数量增多者占比高于BV 和BV 中间型患者（均P＜0.05），见表4。

表2 阴道感染者与无明确致病菌的微生态失调者的乳杆菌减少、H2O2 减少、白细胞增多情况对比[例（%）]

表3 不同感染分类患者的乳杆菌减少、H2O2 减少、白细胞增多情况对比 [例（%）]

表4 不同具体感染类型患者的乳杆菌减少、H2O2 减少、白细胞增多情况对比 [例（%）]

2.3 HPV 感染分布483 例患者中，HPV 阳性者162 例，HPV 感染率33.5%，其中单一型别HPV 感染120 例（120/162，74.1%），多重型别HPV 感染42 例（42/162，25.9%）。在单一型别HPV 感染者中，高危型HPV 感染99 例，低危型HPV 感染15 例，疑似高危型HPV 感染6 例。在高危型HPV 感染者中，发生频次由高到低依次为HPV16（20 例，20.4%）、HPV58（14 例，14.1%）、HPV18（13 例，13.1%）、HPV52（13例，13.1%）、HPV51（10 例，10.1%）、HPV68（8 例，8.1%）、HPV66（5 例，5.1%）、HPV39（4 例，4.0%）、HPV59（3 例，3.0%）、HPV45（3 例，3.0%）、HPV56（2例，2.0%）、HPV31（2 例，2.0%）、HPV33（1 例，1.0%）和HPV35（1 例，1.0%）。在低危型HPV 感染者中，发生频次由高到低依次为HPV6（4 例，26.7%）、HPV43（4 例，26.7%）、HPV81（4 例，26.7%）和HPV42（3 例，19.9%）。疑似高危型HPV 感染者中，发生频次由高到低依次为HPV53（4 例，66.7%）、HPV73（1 例，16.6%）和HPV82（1 例，16.6%）。多重型别HPV 感染者以2 种型别混合感染的患者最多，占50.0%（21/42），HPV16型（18 例）、HPV52（14 例）和HPV18（9例）发生混合感染频次最高。

2.4 阴道微生态失调与HPV 感染的相关性阴道感染者的HPV 感染率（37.1%，130/350）明显高于无明确致病菌的微生态失调者（24.0%，31/129），差异有统计学意义（χ2＝7.262，P＜0.05）。阴道感染者与无明确致病菌的阴道微生态失调患者的HPV 单一或多重型别感染的发生率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。在单一型别HPV 感染者中，阴道感染者与无明确致病菌的阴道微生态失调患者的HPV 感染型别比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表6。

表5 阴道感染与无明确致病菌的微生态失调者的HPV感染状况比较 [例（%）]

表6 单一型别感染者中阴道感染与无明确致病菌的微生态失调的HPV 感染型别比较 [例（%）]

在阴道感染患者中，TV 者HPV 感染率73.3%（11/15），BV 者HPV 感染率52.9%（72/136），AV 者HPV 感染率34.5%（10/29），VVC 者HPV 感染率29.2%（47/161），BV 中间型者HPV 感染率27.4%（20/73），见表7。多因素回归分析结果显示，TV、BV与HPV 感染正相关（OR 分别为5.325 和3.298，均P＜0.05），见表8。

表7 各类型阴道感染的HPV 感染率比较（N=350）

表8 各类型阴道感染与HPV 感染的相关性

3 讨论

女性阴道微生态体系是由阴道内的微生态菌群、机体的内分泌调节功能、免疫调节功能和解剖结构共同组成[5]。正常阴道微生态的平衡状态被打破后，可导致阴道微生态失调，包括临床中常见的各种阴道炎的发生。阴道微生态评价体系通过形态学和功能学两方面对阴道微生态环境进行全面评价，改进了以往对于阴道感染不统一的评价标准。本研究发现，以外阴阴道瘙痒、干涩、疼痛和（或）分泌物异常为主诉就诊的483 例患者中，检测出阴道微生态正常者仅4 例（0.8%），而阴道微生态失调者479 例（99.2%），阴道微生态失调概率远高于健康体检女性（31.3%[6]），提示外阴阴道瘙痒、干涩、疼痛和（或）分泌物异常的患者大部分存在阴道微生态失调。

在阴道感染中，VVC 单一感染（38.7%，111/287）及含VVC 的混合感染（79.4%，50/63）发生率最高，提示VVC 既是最常见的阴道单一感染，也最容易与其他阴道感染同时发生，这与肖彩艳等[7]、郭元元等[8]的研究结果一致，可能是由于VVC 患者通常自觉症状明显，患者能够积极去医院就诊，而本研究的人群都是因外阴阴道瘙痒、干涩、疼痛和（或）分泌物异常来就诊的患者。另外，本研究年龄集中在生育期，此阶段雌激素水平高，易感染VVC。

在功能学分析方面，本研究发现，阴道感染患者表现为乳杆菌数量少、H2O2含量少。乳杆菌能牢固黏附于阴道黏膜上皮，起到占位性保护作用，并且分泌乳酸，维持阴道的酸性环境，产生H2O2、细菌素、生物表面活性物等抑菌物质，引起有益的免疫反应，从而抵挡病原微生物的感染，是女性下生殖道重要的微生物屏障[9]。乳杆菌数量减少，可导致H2O2、乳酸等分泌减少，对其他微生物抑制作用减弱，阴道菌群失调，内外源性致病菌侵袭而致阴道感染。

本研究中有4 例患者阴道微生态正常，其中宫颈HPV 感染者1 例，而在479 例微生态失调患者中，HPV 感染161 例，HPV 感染率达33.6%。而张靖等[10]对2004—2013年公开发表的中英文文献进行Meta 分析发现，我国女性人群宫颈HPV 感染率为25.0%，提示阴道微生态失调容易合并宫颈HPV 感染。在本研究中，进一步比较发现，有明确致病菌的微生态失调患者的HPV 感染率（37.1%）显著高于无明确致病菌的微生态失调患者（24.0%），提示阴道感染更容易并发HPV 感染。

在各种阴道感染中，TV、BV 者HPV 感染率最高，分别为73.3%（11/15）和52.9%（72/136），多因素回归分析结果表明，TV、BV 与HPV 感染正相关（OR分别为5.325、3.298），提示TV、BV 是HPV 感染的危险因素，这与Wang 等[11]、李东燕等[12]的研究结果一致。BV 是阴道内乳酸菌减少，加德纳菌及其他厌氧菌增加所致的混合性感染。目前国内外大多数研究均提示BV 与HPV 感染密切相关[13-16]。BV 感染容易并发HPV 感染的原因可能有：①BV 与HPV 感染有相同的危险因素，比如频繁性交、多个性伴侣及不良的卫生和生活习惯等[17-18]，两者之间有协同关系。②研究发现，在乳杆菌属相对含量较低、pH 值较高的女性中，HPV 的检出率更高[19-20]。而BV 患者阴道内生成乳酸的乳杆菌数量减少，pH 值升高，阴道内生态平衡被破坏，对阴道内微生物的抑制能力下降，容易导致HPV 感染。③阴道加德纳菌有强大的细胞毒性，能够黏附于阴道上皮并在其上形成生物膜，其产生的唾液酸酶和脯氨酸酶，可能在降解几种关键的黏膜保护因子（如黏蛋白）以及促进阴道上皮细胞的脱落和脱离方面发挥作用，从而为其他低致病性的病原体在阴道的定植铺平了道路[21]。关于TV 与HPV感染的相关性目前研究结果尚不一致。有研究认为TV 与HPV 感染无关[13]。但也有研究认为，TV 可增加HPV 的易感性[22-24]。分析原因可能是TV 可引起生殖器官黏膜的损伤、阴道炎和急性炎症性疾病，对包括HPV、人类免疫缺陷病毒（HIV）在内的继发感染能起到催化剂的作用[25-26]。

本研究表明阴道感染容易并发HPV 感染，特别是TV 及BV 与HPV 感染呈正相关，但具体机制目前尚不明确，需待进一步研究。因此，对外阴阴道瘙痒、干涩、疼痛和（或）分泌物异常的患者，在行阴道微生态检测的同时应积极行宫颈HPV 检测，及时治疗阴道感染，维持阴道微生态平衡，对于清除HPV感染、预防宫颈病变有积极作用。