姜黄素对血管性痴呆大鼠认知和记忆功能障碍及海马神经再生的影响

李相华 谭双 刘春芹 李永秋 （唐山市工人医院神经内科,河北 唐山 063000）

血管性痴呆（VD）是一种由脑血管病变引起的脑组织损伤，从而导致认知功能障碍的疾病，主要表现为记忆、认知、思维等功能减退〔1〕。我国60 岁以上的人群VD 发病率为1.3%～2.4%，是仅次于阿尔茨海默病的第二大痴呆类疾病〔2〕。姜黄素是姜黄根茎的主要成分，有抗菌、抗炎、抗氧化等作用，对阿尔茨海默病等神经退行性疾病有保护神经的作用〔3〕。本研究分析姜黄素对VD 大鼠认知和记忆功能障碍及海马神经再生的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与药品 雄性健康SD 大鼠30 只，8 周龄，体重220～250 g，许可证号:SYXK（冀）2019-011，购自华北制药股份有限公司。姜黄素购自广州龙德生物科技有限公司，纯度 99%，批号:19050302，生产批号:SC20141011000026。

1.1.2 试剂与仪器 Morris 水迷宫购自中国医学科学院药物所；蛋白提取试剂盒购自北京普利莱公司；脑源性神经生长因子（BDNF）抗体、酪氨酸蛋白激酶受体（Trk）B 抗体均购自北京义翘神州科技股份有限公司；JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒购自上海翌圣生物科技有限公司；CytoFLEX 流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司；Cleaved Caspase-3、Ki-67抗体购自美国Abcam。

1.2 实验方法

1.2.1 模型建立及实验分组 按照参考文献〔4〕方法，将大鼠随机分为假手术组、模型组和实验组各10 只。4%水合氯醛1 ml/10 g 腹腔注射麻醉大鼠，完全暴露大鼠颈部皮肤，沿皮肤中线切开约1.5 cm切口，将右侧颈总动脉与迷走神经分开后进行分段结扎，结扎后剪断颈总动脉，尾颈总动脉不做处理。假手术组不做结扎与切断颈总动脉。

1.2.2 评定造模成功的标准 按照参考文献〔5〕方法，造模约1 w 后，待大鼠颈部伤口愈合，对大鼠进行Morris 水迷宫行为学测评，以假手术组逃避潜伏期为参考值，计算各组逃避潜伏期与参考值之差，若比值＞20%，则评定为有认知功能障碍的大鼠，即造模成功。

1.2.3 给药方法 造模评定成功后开始给药，实验组给予姜黄素300 mg/kg 灌胃，1 次/d，持续4 w。假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃。

1.2.4 Morris 水迷宫实验 按照参考文献〔6〕方法，各组大鼠在造模成功28 d 后进行Morris 水迷宫，连续5 d，2 次/d。大鼠头朝向池壁从4 个不同的象限中点放入水中，让大鼠在水中自由游动，如果大鼠能在2 min 内爬上平台，则让大鼠在平台上停留30 s，帮助大鼠强化记忆；如果大鼠不能寻找到平台，则由实验者引导大鼠至平台，然后让大鼠在平台上停留30 s。大鼠实际寻找平台的时间为逃避潜伏期。在水池正上方设有摄像系统记录大鼠从不同入水点爬上站台消耗的时间为逃避潜伏期，取当日训练逃避潜伏期的平均值为当日逃避潜伏期。空间探索试验:训练5 d 结束后拆去平台，将大鼠从原平台所在象限的对侧象限中点头朝向池壁放入水中，记录大鼠2 min 内穿越原有平台位置的次数和游动的速度。

1.2.5 Western 印迹检测蛋白的表达 按照参考文献〔7〕方法，取大鼠右侧海马组织加入裂解液，充分裂解后离心30 min，取上清液。1 ∶4加入蛋白缓冲液，煮沸变性10 min。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，转膜，漂洗5 min，5%脱脂奶粉室温封闭60 min，分别加入相应的一抗4℃孵育过夜。次日采用Tris 盐酸缓冲盐溶液加吐温（TBST）漂洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育1 h，电化学发光（ECL）显影，保存图像。运用Image J 软件分析X 光片中条带的灰度值，BDNF、Cleaved Caspase-3、Ki-67、TrkB 表达水平用灰度值表示，内参为β-actin。每个实验重复3 次。

1.2.6 流式细胞术检测海马神经细胞凋亡率 按照参考文献〔8〕方法，将大鼠断头后用75%乙醇消毒5 min，在冰盘上快速分离取出海马，剪碎海马组织轻轻研磨，经300 目筛网过滤，配制细胞悬液，以4 000 r/min离心3 min，去掉上清液，加入JC-1 工作液，37℃避光孵育20 min，用流式细胞仪检测。

1.2.7 细胞计数检测（CCK）-8 实验检测细胞增殖 按照1.2.6 中方法收集细胞，接种到96 孔板内，培养24 h 后，在每个孔内添加CCK-8 溶液10 μl，放在37℃孵育4 h。用酶标仪检测450 nm 的OD 值。细胞存活率=实验组OD 值/对照组OD 值×100%。

1.3 统计学分析 采用SPSS25.0 软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结果

2.1 行为学变化 与假手术组相比，模型组逃避潜伏期显著延长，穿越平台的次数和游动速度明显降低（均P＜0.05）；与模型组相比，实验组逃避潜伏期显著缩短，穿越平台的次数和游动速度显著增加（均P＜0.05）。见表1。

表1 各组逃避潜伏期及穿越原有平台位置的次数和游动速度(,n=10)

表1 各组逃避潜伏期及穿越原有平台位置的次数和游动速度(,n=10)

与假手术组比较:1）P＜0.05；与模型组比较:2）P＜0.05；表2 同

2.2 海马中BDNF、TrkB 蛋白表达 与假手术组相比，模型组BDNF 和TrkB 蛋白的表达显著减少（P＜0.05）；与模型组相比，实验组BDNF、TrkB 蛋白表达显著增加（P＜0.05）。见表2 和图1。

图1 各组BDNF、TrkB 蛋白表达条带

表2 3 组海马BDNF、TrkB 蛋白表达、神经细胞凋亡、存活及Ki-67、Cleaved Caspase-3 表达(,n=10)

表2 3 组海马BDNF、TrkB 蛋白表达、神经细胞凋亡、存活及Ki-67、Cleaved Caspase-3 表达(,n=10)

2.3 海马神经细胞凋亡率 与假手术组相比，模型组海马神经细胞凋亡率和凋亡蛋白 Cleaved Caspase-3 表达量显著升高，细胞存活率和增殖蛋白Ki-67 表达量显著降低（均P＜0.05）；与模型组相比，实验组海马神经细胞凋亡率和凋亡蛋白Cleaved Caspase-3 表达量显著降低，细胞存活率和增殖蛋白Ki-67 表达量显著升高（均P＜0.05）。说明姜黄素可减少海马神经细胞的凋亡。见表2。

3 讨论

VD 占所有痴呆病例的15%～20%，有研究表明〔9〕，海马的胆碱能神经元对学习和记忆功能有重要影响。BDNF 主要分布在大脑皮质、脊髓及海马，BDNF 不仅与神经元的生长及存活有关，而且可调节突触传传递和可塑性，与学习记忆功能有密切关联。BDNF 表达增加是神经元反应性的自我保护，通过与受体TrkB 或p75NTR 结合，能维持神经元存活、减轻神经元损伤〔10〕。BDNF 对于运动神经、中枢及外周神经而言是一个有效的生长因子，BDNF对神经元的存活有关键作用，其可作为信号通路的配体与TrkB 结合，以激活细胞内信号传导通路来促进神经元细胞发育、分化和再生〔11〕。研究表明〔12〕，BDNF 与海马神经发生和海马细胞增殖有关，海马长时程增强作用是由BDNF/TrkB 信号传递诱导的。有研究报道〔13〕，姜黄素能在缺血性脑卒中发挥作用。本实验结果提示BDNF 基因可促进海马细胞增殖，并延长细胞存活时间，这可能是姜黄素促进细胞再生的原因。

综上，姜黄素能改善VD 大鼠认知和记忆功能障碍，通过提高BDNF 和TrkB 蛋白的表达，促进海马神经细胞再生，具有防治VD 的作用。