基于PI3K/Akt 通路下调Smad7 对去势骨质疏松大鼠的干预效果

刘超 王文静 （中国人民解放军陆军第八十集团军医院,山东 淮坊 261000）

绝经后的女性，由于吸收速度大于骨的形成速度，两者处于不平衡状态，易导致骨质疏松（OP）〔1〕。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）是传递重要信号的使者〔2〕。丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt）是可调控细胞生长、代谢、增殖等功能的一种原癌基因〔3〕。Smad7 是一种参与转化生长因子β 超家族细胞内信号转导的抑制蛋白，其参与了细胞凋亡、免疫性疾病等病理生理进程〔4〕。表达异常的Smad7 蛋白通常会给机体带来疾病，在去势OP 模型大鼠成骨细胞中，下调Smad7 可促进细胞增殖和分化〔5〕。本文旨在研究基于PI3K/Akt 通路下调Smad7对去势OP 大鼠的干预效果。

1 材料与方法

1.1 材料 40 只清洁级健康SD 雌性大鼠，鼠龄6～8 w，体重为220～260 g，均购自中山大学（实验动物中心东校区），生产许可:SCXK（粤）2016-0029。大鼠分笼饲养，均在无约束进食及饮水环境下饲养。

1.2 OP 模型建立 从40 只大鼠中任意选取10 只为正常组，其余30 只参考胡倩倩等〔6〕OP 模型，具体操作:对大鼠进行6 h 的禁食，麻醉前将大鼠耳朵、尾部、脖颈部位固定，经大鼠腹腔使用0.3 ml/100 g戊巴比妥钠（上海信裕生物科技有限公司）进行注射麻醉，注射10 min 后将大鼠以仰卧位固定在鼠板上，将大鼠的背部试验区部位除毛，再用酒精（今胜化工有限公司）进行充分消毒，使用经过高温消毒的医用剪刀切开双侧第3 腰推背侧正中皮肤，按照顺序将肌肉、筋膜分离，将卵巢暴露出来，从输卵管端将其结扎，将残余组织归纳完腹腔后缝合切口，建立OP 模型，大鼠均全部建模成功。

1.3 大鼠Smad7 基因的干预及分组 Smad7 的siRNA，5＇-AACGAUCUGCGCUCGUCCGGCGUDTDT-3＇为正义链；3＇-DTDTUUGCUAGACGCGAGCAGGCCGCA-5＇为反义链。将所购买的Smad7 模拟物（Smad7 mimic，上调）、Smad7 抑制物（Smad7 inhibitor，下调）利用Lippofectamine 2000 试剂盒稀释为5 mmol/L，将稀释后的Smad7 模拟物、Smad7 抑制物分别注射于上调组、下调组大鼠胃组织中，空白组、模型组注射同剂量的蒸馏水灌胃，注射24 h 后观察大鼠变化。转染的前1 d，用不含血清和抗生素的高糖DMEM 代替培养液，待24 孔板内细胞融合至80%时，分别将Smad7 基因的siRNA 进行转染，每只大鼠0.5 ml 腹腔注射磷酸缓冲盐溶液，均注射一次，14 d 后，对照磷酸缓冲盐溶液及阴性siRNA，将建模大鼠随机分为即去势OP 组、上调组和下调组，正常组也给予等体积磷酸缓冲盐溶液干预。转染的浓度为50 nmol/L，待1 d 后进行糖氧剥夺（OGD）16 h。

1.4 Smad7 基因检测 采用荧光定量PCR 检测Smad7，用Trizol 的方法，提取所收集的细胞内总RNA，在逆转录酶的作用下合成cDNA。使用荧光定量PCR 仪（雅睿生物科技有限公司）检测Smad7基因及内参GAPDH mRNA 表达，检测试验共重复3次，采用软件Relative Quantification Study 定量分析。共干预12 w。

1.5 病理学观察 股骨头苏木素-伊红（HE）染色步骤:①固定大鼠的股骨头于4%多聚甲醛溶液中。②取出固定的组织，使用手术刀将其切成厚度10 μm的样品。③将样品经乙醇梯度脱蜡至水，随后放入Harris 苏木素染4～10 min，用纯净水清洗。④迅速用1% 的盐酸乙醇进行分色，置于纯净水10～20 min。⑤放入伊红染液中染色3 min。⑥常规脱水后封片，于显微镜下进行观察。

1.6 各组大鼠血清中钙、磷、碱性磷酸酶（ALP）水平及股骨头中骨密度（BMD）、骨钙素（OCN）、Ⅰ型前胶原氨基末端肽（PINP）水平比较 使用戊巴比妥钠进行注射麻醉，取腹主动脉血2 ml，置于转速为3 000 r/min 离心机中进行10 min 的离心处理。分离上血清，置于-80℃的环境中保存血清标本。采用全自动生化仪（海聚慕医疗，批准文号:豫械注准20182400088）检测钙、磷、ALP 水平:设置反应温度、反应时间、主波长分别为37℃、8 min、600 nm，使用蒸馏水在实验前为空白和标准品进行定标。将标准液稀释为1 000 mg/L、600 mg/L、200 mg/L 3 个浓度，各检测2 次取平均值。BMD、OCN、PINP 水平检测:采用双能X 线骨密度仪（圣迅医疗器械有限公司）测定BMD、OCN、PINP 水平，以仰卧位将大鼠固定在鼠板上，用70 和130 kV 开关脉冲稳定的双辐射能量串行扫描大鼠股骨头，分析扫描图像得出BMD、OCN、PINP 水平。

1.7 各组大鼠股骨头中磷酸化（p）-PI3K、p-Akt 蛋白水平比较 应用免疫蛋白印迹（WB）法测定。使用RIPA 缓冲液提取总细胞裂解物，配置含量12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE，恒压80 V，2 h），将蛋白质分离后转移到PVDF 膜，密封于5%脱脂奶粉中，并在4℃下与一抗孵育过夜。用缓冲液洗膜并作用15 min，重复3次。将膜与二抗孵育，于5℃中作用120 min，随后涂上发光剂，曝光并扫描。采用Image J 软件进行灰度分析。参照蛋白为β-actin。

1.8 统计学处理 采用SPSS20.0 软件进行齐性方差、独立样本t检验。

2 结果

2.1 各组大鼠Smad7 基因表达比较 与正常组（0.079±0.008）相比，去势OP 组（0.210±0.012）、上调组（0.193±0.011）、下调组（0.097±0.013）Smad7 基因表达升高，具有统计学意义（P＜0.05）。与去势OP 组相比，上调组、下调组Smad7 基因表达降低，具有统计学意义（P＜0.05）。与上调组相比，下调组Smad7 基因表达明显降低（P＜0.05）。

2.2 各组股骨头HE 染色观察 如图1 所示，正常组骨小梁间隙较大，骨小梁组织几乎无损害；去势OP 组骨小梁间隙小，结构不清晰，且骨小梁吸收慢或不吸收；上调组相较于去势OP 组骨小梁间隙有所增大，骨小梁吸收变快但不明显；下调组细胞质及细胞核颜色分明，骨小梁吸收程度较快，有骨密度升高的表现。

图1 各组股骨头HE 染色观察(×200)

2.3 各组BMD、钙、磷水平比较 见表1。与正常组相比，去势OP 组、上调组、下调组BMD、钙、磷水平均降低，具有统计学意义（P＜0.05）。与去势OP组相比，上调组、下调组BMD、钙、磷水平均升高，具有统计学意义（P＜0.05）。与上调组相比，下调组BMD、钙、磷水平均明显升高（P＜0.05）。

2.4 各组ALP、OCN、PINP 水平比较 与正常组相比，去势OP 组、上调组、下调组ALP、OCN、PINP 水平均明显升高（P＜0.05）。与去势OP 组相比，上调组、下调组ALP、OCN、PINP 水平均明显降低（P＜0.05）。与上调组相比，下调组ALP、OCN、PINP 水平均明显降低（P＜0.05）。见表1。

2.5 各组p-PI3K、p-Akt 蛋白水平比较 与正常组相比，去势OP 组、上调组、下调组p-PI3K、p-Akt 蛋白水平均升高，具有统计学意义（P＜0.05）。与去势OP 组相比，上调组、下调组p-PI3K、p-Akt 蛋白水平均降低，具有统计学意义（P＜0.05）。与上调组相比，下调组p-PI3K、p-Akt 蛋白水平均明显降低（P＜0.05）。见表1、图2。

表1 各组BMD、钙、磷、ALP、OCN、PINP、p-PI3K、p-Akt 水平比较(,n=10)

表1 各组BMD、钙、磷、ALP、OCN、PINP、p-PI3K、p-Akt 水平比较(,n=10)

与正常组相比:1）P＜0.05；与去势OP 组相比:2）P＜0.05；与上调组相比:3）P＜0.05

图2 各组p-PI3K、p-Akt 蛋白表达

3 讨论

OP 是一种以低骨量、骨骼微结构破损而出现的一种全身性骨病，其对骨骼的危害巨大，其致残和致死是老年患者的主要原因之一〔7〕。目前影响OP 的因素较多，一部分人认为形态上的因素（形状、物体受力等）、不正确的生活方式、影响骨代谢的药物及疾病等可影响骨的形成和骨吸收，而大部分研究表明，OP 与遗传、雌激素、营养情况有关〔8〕。绝经后OP 女性由于卵巢功能衰退、雌激素水平降低而减弱对破骨细胞的抑制作用，导致吸收速度大于骨的形成速度，使骨量降低且骨骼呈现细微结构破坏，而容易致使骨折〔9〕。在转化生长因子（TGF）/Smad 蛋白活动信号通路中，Smad7 是其重要的成员，可抑制、调节多种细胞进程。邓纯博等〔10〕指出，Smad7 可以调节破骨和成骨细胞，介入骨骼重塑，而Smad7 本身也可调节绝经后OP。BMD 是表示骨骼强度的一个首要指标，其反映OP 水平，预判骨折的危险性〔11〕。钙是一种银白色的金属元素，在骨骼中，钙是以晶体的形式存在，占体重的2%。钙作为生长发育必不可少的无机盐，可扩张细胞的通透性、促进骨骼、牙齿的发育〔12〕。随着年龄增长，女性绝经后体内的钙营养被大量消耗、BMD 下降而导致OP〔13〕。在人体所有细胞中，都有磷的存在，几乎所有生理上的化学反应都有磷的参与，它是骨骼的构成中不可或缺的材料，可调节体内酸碱平衡、参与人体代谢，而它的作用和活动能力需要维生素D 和钙来维持〔14〕。本文研究中，下调Smad7 可促进BMD、钙、磷水平，进而提高去势OP 模型大鼠骨骼强度。

ALP 是一种经肝脏向胆外排出的糖蛋白，广泛分布于骨骼、肝脏等组织内，是反映骨变的重要指标〔15〕。OCN 是一种维生素K 依赖性钙结合的蛋白质，在骨组织内，其是非胶原蛋白主要成分。OCN在骨钙代谢的调节中有着重要用途，由成牙质细胞、成骨细胞等合成，反映了骨代谢的总体水平〔16〕。在骨代谢指标中，PINP 可评价骨量、预测OP 的出现，且有较高的特异性和敏感性〔17〕。Akt 是一种含有480 个氨基酸残基的蛋白激酶，可保护细胞使其不受凋亡的影响〔18〕。PI3K 在膜转运、信号传导及代谢的过程中有着重要作用，可调节癌症、机体衰老、生物学细胞、组织〔19，20〕。PI3K 通过磷酸化Akt 激活增强雷帕霉素靶体蛋白，使肿瘤抑制基因生成磷脂酰肌醇2 磷酸，进而传递细胞的分化、增殖和迁移〔21〕。本研究结果提示下调Smad7 可改善去势OP模型大鼠骨代谢。综上所述，通过下调Smad7 可提高去势OP 模型大鼠BMD、钙、磷水平，降低去势OP模型大鼠ALP、OCN、PINP、p-PI3K、p-Akt 水平，增强大鼠骨骼强度，调控骨代谢，其作用机制可能与PI3K/Akt 蛋白有关，为其临床应用提供理论依据。