过表达HMGA1 影响动脉粥样硬化血管内皮细胞凋亡和p38MAPK 信号通路

朱沈辉 郦俊 （长沙市第一医院急诊科,湖南 长沙 410005）

动脉粥样硬化（AS）是指主要发生在大中动脉管腔内的慢性炎症及纤维增生性病变，是大部分心血管疾病的病理学基础，具有高的发病率、致残率和死亡率的特点，严重威胁人类的生命健康〔1，2〕。AS形成是一个复杂的过程，其中炎症、氧化应激被认为是AS 的核心发病机制〔3，4〕。有研究表明，内皮细胞损伤是导致AS 和高血压的一个关键因素〔5〕。因此，抑制由氧化应激引起的AS 血管内皮细胞损伤对于其治疗具有重要意义。高迁移率族蛋白（HMG）A1 是一种非组蛋白性质的染色体蛋白，参与包括DNA 复制、转录、重组和修复等多种重要的生理功能调控，其中对基因表达转录调控尤为重要〔6〕。有研究表达，HMGA1 表达与糖尿病大血管病变形成有关〔7〕。此外，也有研究显示，AS 斑块中有HMGA1 蛋白存在，HMGA1 可通过调节CD44 参与AS 形成，是AS 病变发生发展过程的一个重要调节者〔8〕。目前关于HMGA1 对AS 血管内皮细胞生长影响尚未明确。本研究通过过表达人脐静脉内皮细胞（HUVECs）HMGA1 表达，旨在探讨HMGA1 表达对H2O2诱导的HUVECs 增殖凋亡的影响，并进一步研究其作用机制。

1 材料方法

1.1 试剂和仪器 HUVECs 购自美国ATCC。DMEM 培养基、青霉素和链霉素、胎牛血清（FBS）均购自美国Gibco；Lopofectamine 2000 购自美国Invitrogen；MTT、DMSO 及SB203580 均购自美国Sigma；HMGA1、p38MAPK、p-p38MAPK、Bcl-2 和Bax 抗体均购自美国CST；细胞凋亡试剂盒购自南京凯基；酶标仪购自美国Thermo；流式细胞仪购自美国BD。

1.2 研究对象 本研究所用AS 组织来源于长沙市第一医院自2017 年1 月至2018 年1 月经血管造影确诊为AS 患者52 例，其中男28 例，女24 例，年龄51.9～78.2 岁，平均（67.1±11.1）岁。严格排除有糖尿病、心肌梗死病史及曾有心绞痛的AS 患者。上述AS 患者中的20 例，后期进行心血管手术切除斑块组织时，同时切除正常血管组织作为自身正常对照（对照组）。组织采集后做好标记，即可放入液氮中保存。所有样本的采集经医院伦理委员会通过，并签署知情同意书。

1.3 细胞培养 HUVECs 在DMEM 培养基中（含10% FBS 及青霉素和链霉素），于5% 体积分数CO2、37℃及相对饱和湿度的培养箱培养。隔日换液，待细胞生长至融合时，按照实验需要传代。实验为生长至对数期的细胞。

1.4 实验分组及处理 将生长至对数期的HUVECs细胞分为空白组、H2O2组、H2O2+NC 组和H2O2+HMGA1 组。空白组细胞不经特殊处理。H2O2组使用0.5 mmol/L 的H2O2刺激细胞4 h。H2O2+NC 组和H2O2+si-HMGA1 组分别用0.5 mmol/L 的H2O2刺激细胞4 h，再分别转染pcDNA3.1 空载体及重组体pcDNA3.1-HMGA1 48 h。其中pcDNA3.1 的转染参照Lopofectamine 2000 说明进行操作。

1.5 Western 印迹 采用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法对蛋白进行定量。按照50 μg/孔等量上样，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、电转移聚偏氟乙烯（PVDF）膜及封闭膜后，加HMGA1、p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、p-p38MAPK、B 淋巴细胞瘤（Bcl）-2 和Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）抗体（稀释比例1 ∶1000），4℃孵育过夜，次日，TBST 洗膜，加HRP 标记的羊抗鼠二抗，室温孵育1 h，TBST 洗膜，电化学发光（ECL）显色，显影、定量。Quantity One 软件进行灰度值分析。蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH 灰度值。实验重复3 次。

1.6 甲基噻唑基四唑（MTT）法检测细胞活力 以5×103个/孔接种HUVECs 细胞等量于96 孔板，按照1.4 分组处理细胞，处理结束后每孔中加入20 μl的MTT 溶液（5 mg/ml），培养箱中孵育4 h，弃掉上清，加入150 μl/孔的二甲基亚砜（DMSO），摇床震荡10 min，以使结晶能够溶解充分。490 nm 波长下，酶标仪测定吸光度值（A）。以A 值衡量细胞的增殖活力。实验重复3 次。

1.7 AnnexinV-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡 收集按照1.3 分组处理后的细胞，制备成单细胞悬液，收集1×106个细胞。按照膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（AnnexinV-FITC/PI）双染细胞凋亡试剂盒说明。预冷的PBS 洗涤细胞，然后用1×结合缓冲液重悬细胞。分别加入5 μl 的AnnexinV-FITC和5 μl 的PI，避光孵育10 min，1 h 内通过流式细胞仪检测。实验重复3 次。

1.8 制p38MAPK 信号对HUVECs 细胞活力和凋亡影响 使用5 mmol/L 的p38MAPK 信号通路抑制剂SB203580 处理HUVECs 细胞，细胞分为H2O2组、H2O2+SB203580 组和H2O2+SB203580+HMGA1组。通过MTT 法及流式细胞术分别检测3 组细胞活力和凋亡率。

1.9 统计学方法 采用SPSS21.0 软件进行方差分析、SNK-q检验。

2 结果

2.1 AS 组织HMGA1 表达 以正常血管组织作为对照，AS 患者斑块组织HMGA1 表达（0.481 ±0.052）明显高于对照组（0.046±0.006，P＜0.05）。见图1。

图1 Western 印迹检测AS 患者斑块组织HMGA1 表达

2.2 HMGA1 在H2O2诱导的HUVECs 细胞表达 空白组、H2O2组、H2O2+NC 组和H2O2+HMGA1 组HMGA1 蛋白表达差异有统计学意义（0.711 ±0.058、0.053±0.006、0.074±0.009、0.335±0.026；F=271.396，P＜0.05）。与空白组比较，H2O2组和H2O2+NC 组HMGA1 表达明显降低（P＜0.05），H2O2组和H2O2+NC 组间HMGA1 表达差异无统计学意义（P＞0.05），与H2O2+NC 组比较，H2O2+HMGA1 组HMGA1 表达明显升高（P＜0.05）。见图2。

图2 Western 印迹检测H2O2 诱导的HUVECs细胞HMGA1 蛋白表达

2.3 HMGA1 表达对H2O2诱导的HUVECs 细胞活力影响 空白组、H2O2组、H2O2+NC 组和H2O2+HMGA1 组A 值差异具有统计学意义（0.806 ±0.062、0.432±0.038、0.424±0.035、0.671±0.056；F=43.758，P＜0.05），H2O2可明显降低HUVECs 细胞活力，而过表达HMGA1 后细胞活力明显升高（P＜0.05）。

2.4 HMGA1 表达对H2O2诱导的HUVECs 细胞凋亡影响 空白组、H2O2组、H2O2+NC 组和H2O2+HMGA1 组细胞凋亡率差异具有统计学意义〔（2.47±0.34）%、（30.97 ± 1.65）%、（30.60 ±1.57）%、（15.77±1.01）%；F=284.271，P＜0.05〕。H2O2可明显诱导HUVECs 细胞凋亡，而过表达HMGA1 后细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。见图3。

图3 流式细胞术检测过表达HMGA1 后HUVECs 细胞凋亡率

2.5 HMGA1 表达对H2O2诱导的HUVECs 细胞p38MAPK 信号通路影响 空白组、H2O2组、H2O2+NC 组和H2O2+HMGA1 组p38MAPK 蛋白表达分别为（0.682 ±0.058、0.662 ±0.054、0.691 ±0.059、0.690 ± 0.060），p-p38MAPK 蛋白表 达分别 为（0.023±0.005、0.134±0.015、0.148±0.016、0.078±0.010），Bcl-2 蛋白表达分别为（0.654 ±0.062、0.089±0.011、0.096±0.013、0.547±0.056），Bax 蛋白表达分别为（0.067±0.008、0.482±0.052、0.491±0.053、0.166±0.018），4 组的p-p38MAPK、Bcl-2、Bax 蛋白表达差异均具有统计学意义（F=64.691、145.152、96.147，均P＜0.05）而p38MAPK 蛋白表达整体比较差异不显著（F=0.163，P＞0.05），见图4。H2O2可明显上调HUVECs 细胞p-p38MAPK 和Bax表达，下调Bcl-2，而过表达HMGA1 后p-p38MAPK和Bax 表达明显降低，Bcl-2 表达明显升高（P＜0.05）。

图4 Western 印迹检测过表达HMGA1 后HUVECs 细胞p38MAPK、p-p38MAPK、Bcl-2 和Bax 蛋白表达

2.6 抑制p38MAPK 信号通路对H2O2诱导的HUVECs 细胞活力和凋亡影响 H2O2组、H2O2+SB203580 组和H2O2+SB203580+HMGA1 组细胞A值（0.438±0.041、0.613±0.049、0.825±0.069），凋亡率〔（30.47±1.72）%、（17.03±1.21）%、（6.90±0.72）%〕 差异均 有统计 学意义（F=38.223、236.164，均P＜0.05），见图5。与H2O2组比较，H2O2+SB203580 组细胞活力明显升高，凋亡率降低（P＜0.05），与H2O2+SB203580 组比较，H2O2+SB203580+HMGA1 组细胞活力明显升高，凋亡率降低（P＜0.05）。

图5 流式细胞术检测各组细胞凋亡率

3 讨论

血管内皮细胞功能异常与AS 发生发展密切相关，是AS 一系列改变的始动者〔9〕。活性氧是导致内皮损伤的一个主要因素〔10〕。H2O2是机体产生的活性氧，可通过对生物膜中多不饱和脂肪酸过氧化引起细胞损伤，最终导致AS 形成，并加重动脉狭窄及增加血管支架成型术后再狭窄发生率〔11〕。目前多项研究实现，H2O2可引起细胞内皮损伤、凋亡〔12〕。本研究也使用H2O2为处理因素建立血管内皮细胞损伤模型。HMG 家族在高等真核生物细胞核中广泛分布，广泛的参与多种重要的核内生物学功能调节，HMGA1 基因定位于人类第6 号染色体，其表达水平高低与多种肿瘤恶性程度密切相关〔13，14〕。最近的研究表明，HMGA1 表达减少被证实与2 型糖尿病发生及胰岛素抵抗有关〔15〕。HMGA1 突变可增加胰岛素抵抗及代谢性综合征的风险，而糖尿病是导致AS 的重要危险因素之一〔16〕。HMGA1 在AS 中研究较少，已有研究表明，AS 中HMGA1 呈现阳性表达〔8〕。本研究通过H2O2刺激HUVECs 细胞，检测HMGA1 过表达对细胞活力和凋亡影响，结果显示，HMGA1 可明显降低H2O2对HUVECs 细胞生长抑制和凋亡促进作用。提示HMGA1 对AS 具有保护作用。MAPKs 级联是细胞内重要的信号转导方式之一，在哺乳动物中广泛存在，可将细胞外信号转导至胞内，从而引起细胞增殖、凋亡、分化等生物学改变，对多种心血管疾病进展均发挥重要调节作用〔17，18〕。p38MAPK 是MAPKs 超家族成员之一，有研究表明，AS 形成过程与p38MAPK 信号激活存在密切关系，p38MAPK 信号通路的激活可促进VSMCs 增殖信号传入细胞核，使其从中膜浸入内膜，并发生增殖，从而促进AS 的形成〔19，20〕。有研究显示，使用p38MAPK 抑制剂SB203580 干预HUVECs 细胞，可明显降低细胞凋亡率，上调Bcl-2 及下调Bax 表达〔21，22〕。Bcl-2 家族成员与细胞凋亡密切相关，Bcl-2 和Bax 分别为Bcl-2 家族的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，其比例可决定细胞是否发生凋亡。Bcl-2 表达升高，Bax 表达降低，可抑制细胞凋亡〔23，24〕。本研究结果提示HMGA1 可能通过抑制p38MAPK 信号对VSMCs 细胞损伤起保护作用。进一步研究表明，SB203580 可降低VSMCs 细胞增殖，抑制细胞凋亡，并增加HMGA1 对细胞增殖和凋亡的影响。说明HMGA1 可通过抑制p38MAPK 信号影响VSMCs 细胞生长。

综上所述，本研究发现HMGA1 在AS 斑块组织高表达，HMGA1 可通过抑制p38MAPK 信号降低H2O2诱导的VSMCs 细胞凋亡，提高细胞增殖。提示HMGA1 可能是AS 治疗的有效靶点之一。