MCLK1 对HT22 细胞凋亡的影响及机制

赵学萍 孟宪勇 张晗 董晓华

（河北北方学院 1 神经药理学重点实验室,河北 张家口 075000;2 附属第一医院）

衰老是一种自然规律，随着时间的推移，机体常常表现出学习记忆能力的下降。海马是最早被认为在学习与记忆过程中起关键作用的中枢结构，因此海马神经元细胞被广泛作为学习记忆的模型。

MCLK1 是一种被发现于秀丽隐杆线虫中的生物钟基因，在线粒体代谢调节和衰老中发挥重要作用。线虫MCLK1 突变失活〔1～3〕和小鼠MCLK1 部分失活〔4～6〕延长了这些生物的平均和最大寿命。有文献报道称，MCLK1 蛋白的缺失对脑缺血有一定的保护作用，对MCLK1+/-小鼠进行脑缺血再灌注后发现，MCLK1+/-小鼠前额叶皮层和海马部位变性退化的神经元数量显著少于野生型小鼠〔7〕。本课题组前期分别选取3 月龄和15 月龄的C57BL/6-MCLK1基因敲 除小鼠（MCLK1+/-）与野生 型小鼠（MCLK1+/+），利用Morris 水迷宫测定空间认知能力后发现，MCLK1+/-小鼠空间学习记忆能力均较野生型小鼠增强。提示MCLK1 基因可能参与海马神经元细胞凋亡的调节，但具体机制尚未清楚。本实验将进一步探究MCLK1 与海马神经元细胞的关系，探讨MCLK1 蛋白表达减少对小鼠海马神经元细胞系（HT22 细胞）凋亡的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 小鼠海马神经元细胞系HT22细胞（苏州大学神经精神疾病研究所赠予）；MCLK1慢病毒（购自上海吉玛制药技术有限公司）；DMEM/High Glucose（购自美国Hyclone 公司）；胎牛血清（购自美国Gibco 公司）；MCLK1，低氧诱导因子（HIF）-1 抗体（购自美国Proteintech 公司）；B 细胞淋巴瘤（Bcl）-2、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax），半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase）-3、酶切（cleaved）-Caspase-3，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K），蛋白激酶B（Akt），磷酸化（p）-Akt（购自美国Cell Signaling 公司）；PCR 试剂盒（购自日本TaKaRa 公司）；引物（购自上海生工生物工程有限公司）；原位末端标记（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（购自碧云天公司）。

1.2 仪器与设备 二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）；倒置荧光显微镜（日本Nikon 公司）；C1000 Touch 聚合酶链反应（PCR）仪和蛋白电泳仪、湿转仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 慢病毒包装 对数期生长的293T 细胞在15 cm 培养皿中培养至60%融合时，将重组慢病毒的骨架质粒与包装质粒用RNAi-Mate 共转染至病毒包装细胞293T，培养6 h 后弃去原来培养液，加入新鲜的细胞培养液继续培养。72 h 后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，3 600 r/min 4℃离心4 min，用0.45 μm 过滤器过滤，滤液在离心机中进行超速离心，13 000 r/min 4℃离心2 h，将浓缩液收集分装后-80℃冰箱保存。该实验步骤由上海吉玛制药技术有限公司完成。

1.3.2 慢病毒滴度检测 293T 细胞按3×104细胞/孔的浓度接种96 孔板，混匀后于37℃5% CO2培养24 h；将病毒原液10 μl，用10% 胎牛血清（FBS）的DMEM 培养液10 倍稀释3～5 个梯度；吸去96 孔板中的培养液，每孔加入100 μl 10%FBS 的DMEM 培养液，于37℃5%CO2继续培养72 h；通过荧光显微镜计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。该实验步骤由上海吉玛制药技术有限公司完成。

1.3.3 慢病毒转染 将细胞以1×105/孔铺到六孔板中，培养24 h 后进行转染，实验分为两组，慢病毒转染组（Lv-MCLK1 组）与阴性对照组（Lv-NC 组），每组3 个复孔。将12 μl 聚凝胺（Polybrene）加入12 ml DMEM 基础培养基，每孔加入2 ml。取20 μl MCLK1 慢病毒加入70 μl DMEM 基础培养基，每孔加入30 μl，共3 个复孔。取10 μl NC 加入80 μl DMEM 基础培养基，每孔加入30 μl，共3 个复孔，37℃孵育24 h 后用含血清的完全培养基换原培养基，培养24 h、48 h、72 h 后荧光显微镜下观察转染效率。

1.3.4 TUNEL 染色 将两组细胞接种于24 孔板，每孔密度大约1×105/孔，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1 次。4%多聚甲醛固定细胞30 min，用PBS 洗涤1 次；加入0.3% Triton X-100 的PBS，室温孵育5 min，用PBS 洗涤1 次；在PBS 配制的0.3%过氧化氢溶液中室温孵育20 min，以灭活切片内源性过氧化物酶，随后用PBS 洗涤3 次；在样品上加50 μl TUNEL 检测液，37℃避光孵育60 min，用PBS 洗涤1次，滴加0.1～0.3 ml 标记反应终止液，室温孵育10 min，用PBS 洗涤3 次；在样品上加50 μl 辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（Streptavidin-HRP）工作液，室温孵育30 min，用PBS 洗涤3 次；滴加0.2～0.5 ml二氨基联苯胺（DAB）显色液，室温孵育15 min，用PBS 洗涤3 次；苏木素复染15 s，PBS 洗涤3 次。光学显微镜下观察。400 倍下选择5 个具有代表性的视野，计数阳性细胞数和阴性细胞数，并计算阳性细胞表达百分率，阳性表达百分率=阳性细胞数/（阳性细胞数+阴性细胞数）×100%，计算平均值。

1.3.5 Western 印迹PBS 清洗细胞后，将细胞刮下，离心沉淀，每皿加入300 μl 蛋白裂解液，冰上裂解2 h，10 000 r/min 4℃离心30 min，取上清液置新的离心管中，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量，按照1 ∶4的比例加入5×蛋白上样缓冲液，95℃变性10 min，取30 μg 蛋白样品，进行十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），100 V 湿转90 min，将膜放入封闭液室温缓慢摇动2 h，加入一抗4℃过夜，TBST 洗3 次，每次10 min，加入二抗，室温轻摇2 h，TBST 洗3 次，每次10 min，用ECL 工作液化学发光。抗体稀释倍数:鼠单克隆抗体β-actin（1 ∶10 000），兔单克隆抗体MCLK1（1 ∶200），Bax（1 ∶500），Bcl-2（1 ∶800），Caspase-3（1 ∶500），cleaved-Caspase-3（1 ∶500），PI3K（1 ∶500），Akt（1 ∶500），p-Akt（1 ∶500）。HRP 标记山羊抗鼠IgG（1 ∶10 000），HRP 标记山羊抗兔IgG（1 ∶20 000）。图像扫描后用ImageJ 进行灰度值分析。

1.3.6 实时荧光定量PCR 将HT22 细胞接种于6孔板中，密度大约2×105/孔时，加入病毒24 h 后收集细胞，细胞沉淀中加入1 ml RNA 裂解液，200 μl氯仿，10 000 r/min，4℃离心15 min；转移上清到新的离心管中，每管加入等体积的异丙醇，室温静置10 min，10 000 r/min，4℃离心15 min；弃掉上清，加入预冷无水乙醇清洗沉淀，10 000 r/min，4℃离心5 min；弃去上清，室温干燥15 min，用适量RNasefree-water 溶解沉淀。经过总RNA 提取后检测RNA浓度，72℃，10 min；42℃，60 min，72℃，15 min 进行反转录得到cDNA，进行q-PCR，条件:95℃，10 min；95℃，15 s，60℃，1 min，40 ct；每个基因设3 个复孔，实验结果采用2-△△Ct法分析数据。基因引物序列见表1。

表1 目的基因的引物序列

1.4 统计学处理 采用SPSS19.0 软件进行独立样本t检验。

2 结果

2.1 TUNEL 染色结果 光镜下观察，TUNEL 染色及苏木素复染后凋亡细胞核呈棕色，位于胞核，由于凋亡细胞所处的时期不同，细胞呈环形、小圆形或颗粒状、椭圆形等不同形状，提示凋亡细胞有典型的新月体状、核浓缩及大量微核体的形成，正常细胞核呈蓝色。与Lv-NC 组相比，Lv-MCLK1 组的HT22 细胞的阳性细胞数明显较少〔（8.06±0.77）% vs（4.13±1.06）%，P＜0.01〕，见图1。

图1 TUNEL 检测MCLK1 对HT22 细胞凋亡的影响(×400)

2.2 MCLK1 及HIF-1 的表达 Lv-MCLK1 组MCLK1 蛋白表达水平显著低于Lv-NC 组（P＜0.01），HIF-1 表达水平明显高于Lv-NC 组（P＜0.01），表明降低MCLK1 蛋白水平能够促进HIF-1蛋白的表达，见图2、表2。

图2 转染MCLK1 慢病毒对HT22 细胞中MCLK1、HIF-1 蛋白表达的影响

2.3 PI3K/AKT 信号通路蛋白的检测 Lv-MCLK1组HIF-1，p-Akt 水平明显高于Lv-NC 组（P＜0.01），而Akt 并未发生明显变化（P＞0.05），见表2、图3。

表2 两组MCLK1、HIF-1、PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表达变化(,n=3)

表2 两组MCLK1、HIF-1、PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表达变化(,n=3)

图3 转染MCLK1 慢病毒对HT22 细胞中p-Akt、Akt、PI3k 蛋白表达的影响

2.4 凋亡相关蛋白的检测 与Lv-NC 组相比，Lv-MCLK1 组Bax 水平没有明显变化，Bcl-2 水平明显升高（P＜0.01），Bax/bcl-2 比值下降（P＜0.01），Caspase-3、cleaved-Caspase-3 蛋白水平显著降低（P＜0.01），见图4、表3。

图4 转染MCLK1 慢病毒对HT22 细胞中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、Caspase-3 蛋白表达的影响

2.5 采用RT-qPCR 检测mRNA 水平的变化 Lv-MCLK1 组中Bcl-2（P＜0.05）、Bax（P＜0.01）的mRNA 水平较Lv-NC 组升高，但是Bax/Bcl-2 的mRNA水平无明显变化（P＞0.05），Caspase-3 的mRNA 水平明显降低（P＜0.01），见表3。

表3 两组Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3 蛋白及mRNA 表达(,n=3)

表3 两组Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3 蛋白及mRNA 表达(,n=3)

3 讨论

本研究利用细胞转染技术，降低MCLK1 表达，同时进行TUNEL〔8〕，发现凋亡细胞有典型的新月体状、核浓缩及大量微核体的形成，并且降低MCLK1的表达可以抑制HT22 细胞凋亡。因此猜想，MCLK1+/-小鼠学习记忆能力改善可能与MCLK1 表达不足在一定程度上减少海马神经元细胞的凋亡有关。

HIF-1 诱导物能增加HIF-1 及其靶基因的表达，具有抑制tau 蛋白异常磷酸化，保护神经元的作用〔9〕。HIF-1 可能通过PI3K/Akt 通路发挥神经保护作用，并且Akt 信号通路对Bax、Bcl-2、Caspase-3的mRNA 和蛋白质表达均具有调控作用〔10〕。MCLK1 缺失时，HIF-1 蛋白表达水平升高〔11〕，本实验结果与之前文献报道一致。提示MCLK1 可能通过HIF-1 对神经元凋亡产生一定影响。检测PI3K/Akt 信号通路中相关蛋白后提示HT22 细胞中MCLK1 蛋白缺失后HIF-1 水平上调可能是PI3K/Akt 信号通路被激活的原因之一，激活的PI3K/Akt信号通路可能对HT22 细胞的凋亡、生存等功能产生一定影响。

神经细胞凋亡受多种因素调控，凋亡因子对神经细胞起直接调控作用，包括Bax、Bid、Bcl-2 等〔12，13〕。研究表明，脑原代皮质神经元培养物中Bcl-2 过表达能够产生抑制神经元凋亡作用，Bax 为促凋亡因子，能够拮抗Bcl-2 的抗凋亡作用，引发神经细胞凋亡〔14〕。Caspase-3 是细胞凋亡过程中发挥重要功能的凋亡执行蛋白之一，Caspase-3 通过酶原活化发挥各种功能，然而Caspase-3 基因表达水平在一定程度上影响着酶原的水平，近年来，越来越多证据表明，Caspase-3 基因表达水平也与多种疾病过程密切相关，如大鼠短暂性脑缺血后，下丘脑CA1 区椎体神经元Caspase-3 的mRNA 水平随时间上调〔15，16〕。本研究结果提示MCLK1 可能通过调节Bcl-2 及Caspase-3的表达及激活程度来影响细胞的凋亡，但对其他凋亡相关蛋白是否也有作用，需要我们更深入、全面的研究。qRT-PCR 检测Bcl-2、Bax、Caspase-3 的mRNA 水平后发现，病毒转染组中Caspase-3 的mRNA 水平明显下降，Bax，Bcl-2 基因水平同时上调，Bax/Bcl-2 无统计学意义，这与我们在蛋白水平观察到的Bax 没有明显变化不一致，或许MCLK1 促进了Bax mRNA 转录，但间接通过另一途径抑制了其蛋白表达或促进了蛋白降解，而最终出现mRNA 与蛋白水平不一致，其具体的机制还需要进一步研究。