基于分子对接和网络药理学的黄芪-桑寄生-木瓜药对治疗骨关节炎的作用机制

涂泽松 罗汉文 谭志韵 岑景盛 （佛山市中医院骨科,广东 佛山 528000）

骨关节炎（OA）是一种以关节和骨骼结构呈进行性损伤为主要病理特征的慢性疾病，其中主要以关节软骨受损最严重，如病情持续进展后期可逐渐出现关节僵硬、疼痛、畸形等症状〔1～3〕。此病好发于中老年患者，但也有研究证实青少年发病率也呈现上涨趋势〔4，5〕。OA 的发病与年龄、肥胖、创伤、炎症、过度运动、遗传等多种因素关系密切，但其中复杂的发病机制仍无明确阐述〔6〕。目前OA 的治疗方案主要以缓解疼痛、改善关节活动度为主要治疗目标，多采用口服非甾体抗炎药及关节腔内注射玻璃酸钠等对症治疗为主〔7，8〕。虽然上述治疗策略对OA 症状缓解疗效明显，但对延缓关节炎症的发展进程作用有限，且长期服用常引起胃肠道损害、耐药等较大不良反应〔9，10〕。因此，寻求高效低毒的治疗药物对OA 患者具有重要意义。

许多临床文献报道已证实中医药治疗OA 的有效性〔11，12〕。其中中药对是古今医家在与疾病抗衡中运用中医学理论辨证施方的“配伍”核心，虽组成简单但在减毒增效方面又强于单味中药〔13〕。黄芪、桑寄生及木瓜三药常相互配伍为治疗OA 的古今经典方剂所用，如麻黄温痹汤、西藏雪莲药酒。《名医别录》中记载，桑寄生有“去痹”奇效，《日华子本草》原文表明桑寄生有“助筋骨，益血脉”诸功，而《本草纲目》也表明木瓜主治“转筋及腰膝”。此外，中医学认为OA 患者病程绵长难愈的特点与人体体质状况及正气休戚关系密切，如《素问遗篇.剌法》认为此病发生责之于正虚:“正气存内，邪不可干；邪之所凑，其气必虚”。故笔者认为OA 治疗应以补益正气为主，正虚得纠则血瘀络阻自解，疾病渐愈。故临床施方多配于有“补气诸药之最”之美称的黄芪，《医学衷中参西录》中曰:“黄芪能补气，兼能升气，善治胸中大气下陷”，三者配伍合用优势互补，具补气生血、舒筋活络、强筋健骨之功，黄芪-桑寄生-木瓜药对成分众多，致使其中抗骨关节炎机制过于复杂，难以阐明。本研究拟通过此药对为着眼点，结合药对中所含化学成分、作用靶点和分子对接方面探究其分子机制，进而开展网络药理学分析，为黄芪-桑寄生-木瓜药对治疗OA 的药效物质基础与分子层面相关作用机制的充分明确给予科学依据。

1 材料及方法

1.1 材料 药物中重要化合物数据源自中药系统药理学分析（简称为“TCMSP”）数据库，源自数据库GeneCards 与OMIM 的疾病相关靶点。PPI 网络互作关系来源于STRING 数据库。David6.8 数据库进行共同靶点GO 富集和Kegg 代谢通路富集。

1.2 黄芪-桑寄生-木瓜药对活性成分筛选 通过使用TCMSP 数据库对黄芪-桑寄生-木瓜药对重要活性成分及药物作用潜在靶点进行筛选。以下为药物筛选条件:口服利用度（OB）及类药性（DL）分别为30%、0.18 及以上水平。部分化合物的DL 值虽然偏低，然而已有研究结果证实此类化合物切实具备一定活性，因此将其作为纳入对象〔7〕。通过获得的活性成分及其对应的潜在靶点进行成分-靶点作用关系网络图，筛选出药对中作用最强的化合物。

1.3 疾病相关靶点的收集 借助数据库GeneCards（https://www.genecards.org/）及OMIM 数据库（http:// www.omim.org/）分别搜集OA 疾病相关靶点，取并集，表示可能为OA 潜在靶点。

1.4 药物与疾病共同作用靶点 将1.3 中获取的疾病相关靶点与1.2 中收集的药对化合物潜在作用靶点通过Venny 系统平台进行映射，取两者交集，此可能为药物与疾病共同作用靶点，将这些靶点向数据库STRING 内导入，获取蛋白靶点之间的互作关系网络图（PPI 图），使用Cytoscape3.7.0 软件将其相关信息进行网络拓扑学分析，以2～3 倍中位数为筛选条件，筛选出关键作用靶点。借助MCODE 插件分析PPI，通过所得模块，完成化合物靶点网络图的构建。

1.5 交集基因GO 富集及KEGG 通路富集研究 针对所得交集基因，借助数据库David6.8 开展GO与KEGG 代谢通路这两项富集分析，进一步剖析黄芪-桑寄生-木瓜药对治疗OA 潜在作用机制。

1.6 分子对接 使用ChemOffice 软件将重要化合物的3D 结构进行构建，为了使能量最小化，以mol2格式存储。借助PDB 获取相互作用最密切的几个靶点的3D 结构*PDB 格式，借用PyMOL 软件对蛋白质进行去水、加氢等操作，利用Auto Dock Tools 软件将化合物及靶点蛋白格式均转换为*pdbqt 格式，最后通过运行Vina.exe 软件进行对接。若结合能＜0，说明配体与受体之间可以自发结合，由于目前对于活性分子靶点的筛选尚无统一标准，本研究选取结合能≤-5.0 kJ/mol 的活性成分作为黄芪-桑寄生-木瓜药对治疗OA 靶点的筛选依据。

2 结果

2.1 黄芪-桑寄生-木瓜药对重要化合物成分 在TCMSP 中数据中检索找到化合物:黄芪87 个，桑寄生46 个，木瓜80 个。通过1.2 的严格筛选进一步剔除重复化合物的化合物，共获得化合物23 个，见表1。进一步剔除无对应作用蛋白靶点的化合物，共有重要化合物19 个。

表1 黄芪-桑寄生-木瓜药对化合物信息

2.2 黄芪-桑寄生-木瓜药对重要化合物-作用靶点网络图分析 分析药对内的19 个关键化合物及98个靶点基因后，借助Cytoscape3.7.1，完成这些化合物与相应靶点的网络构建，同时开展拓扑学研究。在拓扑学分析方面，所借助的工具为软件Cytoscape3.7.1 配备的分析工具Network Analyzer，经由网络内各节点的度值（degree），对此节点的关键性展开评估，见图1。经拓扑学分析能够明确，该网络图中有120 个节点，470 条边，以节点度由大到小排序，化合物中排名靠前的有:槲皮素（MOL000098）度值79，山奈酚（MOL000422）度值34，7-O-甲基异丁香酚（MOL000378 ）度值 19，异鼠李素（MOL000354）、（6aR，11ar）-9，10-二甲氧基-6a，11a-二氢-6h-苯并呋喃〔3，2-c〕铬-3-醇（MOL000380）等重要化合物。作用靶点节点度靠前的有:NCOA2（12）、PTGS1（12）、PRSS1（10）。通过重要化合物与作用靶点之间的关系网络图可知，一个化合物可以作用于多个靶点，同时多个化合物也可以共同作用于一个靶点，说明黄芪-熟地-山茱萸药对可能是通过多成分、多途径、多靶点共同起效作用于疾病。

2.3 OA 疾病靶点及交集基因分析 GeneCards 数据中按照Relevance score≥4 检索获得OA 疾病靶点527 个，检索OMIM 数据库获得29 个疾病有关靶点，对重复靶点汇总删除处理后，最后所得强直性脊柱炎（AS）靶点为549 个。对于全部OA 靶点和药物关键化合物靶点，借助在线分析软件Draw Venn Diagrams 实施映射取交集处理，得到26 个共同作用靶点基因。

2.4 OA 疾病与黄芪-桑寄生-木瓜药对化合物共同作用靶点交集蛋白基因分析 将共同作用基因导入STRING 数据库及与Cytoscape3.7.0 相结合通过拓扑学分析得到，该网络图中聚类系数为0.735，节点为26，特征路径长度为1.457，平均节点度为13.615，以靶点基因度值大于1.5 倍的平均节点度为筛选条件，筛选出白细胞介素（IL）-6（23）、胱天蛋白酶（CASP）3（22）、血管内皮生长因子（VEGF）A（22）、丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）8（21）靶点，说明这些基因靶点与OA 的发病与治疗存在密切的联系，蛋白互相作用见表2、图2。

图2 共同作用蛋白靶点互作网络(作用越密切,连线越粗,相互作用越多,点越大)

表2 OA 疾病与黄芪-桑寄生-木瓜药对共同作用靶点的度值和介数

2.5 OA 疾病与黄芪-桑寄生-木瓜药对共同作用靶点的生物信息学分析 通过David 数据库对映射出的26 个共同作用靶点GO 富集及KEGG 代谢通路富集分析，通过Bonferroni 校正，P＜0.05，GO 富集出生物过程（BP）39 个，主要为:凋亡过程的负调控、巨噬细胞衍生的泡沫细胞分化的负调控、对肌肉伸展的反应、对药物的反应、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物过程。分子功能（MF）4 个，主要为:转录激活子（ATF）活性，RNA 聚合酶（pol）Ⅱ核心启动子近端部位序列特异性结合、纤连蛋白结合、染色质结合、天冬氨酸型内肽酶活性。细胞成分（CC）5 个，主要为:细胞外空间、核、胞质溶胶、质膜的外侧、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子复合物。通过使用GraphPad Prism8.0.1 软件将GO 富集可视化条形图（图3）。KEGG 代谢通路富集出62 条信号转导通路。其中P值大小进行排序，发现17 条代谢通路与膝关节OA 关系最为密切，其中涉及肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、催乳素（PRL）信号通路、核因子（NF）-κB 信号通路、NLR 信号通路、TLR 信号通路、HIF 信号通路，使用OmicShare 数据库将KEGG 通路内富集所得靶点数与P值，进行气泡图（如图4）的绘制。通过此图能够发现，1 条KEGG 通路通常富集至若干个靶点基因，而1 个靶点基因又可同时见于若干条通路内。

图3 作用靶点的GO 富集分析(橙色为生物过程BP；绿色为细胞组成CC；蓝色为MF)

图4 作用靶点的KEGG 通路分析的气泡图(前40 条)

2.6 黄芪-桑寄生-木瓜药对中核心化合物及与OA重要靶点蛋白分子对接研究 现已明确，配体结合受体环节，能量愈弱，构象稳定性愈强，愈易于发生作用，此项研究中，将结合能≤-5.0 kJ/mol 作为其对接的筛选标准。结果显示OA 疾病与黄芪-桑寄生-木瓜药对中重要活性化合物与其共同作用的重要靶点分子对接亲和力均远远＜-5.0 kJ/mol，因此，可以很好表明黄芪-桑寄生-木瓜药对中重要活性化合物与OA 疾病的重要作用靶点有较好的结合活性，亦证明黄芪-桑寄生-木瓜药对治疗OA 具有良好的作用。分子对接结果见表3、图5、图6。

图5 CASP3 靶点蛋白与重要化合物分子对接结果

图6 IL6 靶点蛋白与重要化合物分子对接结果

表3 黄芪-桑寄生-木瓜药对中核心化合物及与OA 重要靶点蛋白的结合能

3 讨论

OA 是一种以关节软骨进行性损伤合并关节周围骨质增生为典型病理表现的慢性疾病〔14〕。目前多以老年群体常见，西医治疗方案多以对症治疗为主，而尚无遏制病源的方案〔15〕。中医学认为OA 属“骨痹”“痹病”范畴，属本虚标实之证〔16，17〕，补益肝肾，舒筋活络，精血充实，则筋骨得养，病渐痊。黄芪、桑寄生及木瓜三药属补益肝肾，强壮筋骨，舒筋活络之品，且临床配伍运用于中药复方多具备价廉、低毒及剂型丰富等优点，值得推荐。

槲皮素是类黄酮家族的成员，在退行性疾病中具有抗氧化和抗炎特性。Feng 等〔18〕通过研究发现槲皮素可减轻氧化应激、内质网应激及相关细胞凋亡水平。此外，槲皮素通过激活sirtuin1/腺苷单磷酸激活的蛋白激酶（SIRT1/AMPK）信号通路来抑制内质网应激，侧面印证了槲皮素可以保护SD 大鼠的OA 表现。Zhang 等〔19〕通过使用木瓜蛋白酶注射入关节腔来诱导OA 模型大鼠，结果表明，加入槲皮素治疗的大鼠，TLR-4/NF-κB 信号传导明显受到抑制，而模型组大鼠的TLR-4/NF-κB 途径受到刺激，说明槲皮素可以抑制这些OA 大鼠中炎症因子（IL-1b 和TNF-α）的分泌，改善OA 症状（关节直径和脚趾体积）。Noriyuki 等〔20〕观察到槲皮素能有效改善中老年OA 患者Ⅱ型胶原的合成/降解平衡。Hiroaki 等〔21〕研究也证明槲皮素对改善老年OA 患者滑液特性有特殊作用。

众所周知，山奈酚及其糖苷均具有药理活性，包括有抗炎、抗癌、抗微生物、抗糖尿病、抗过敏、镇痛、心脏保护和神经保护作用〔22～24〕。研究表明〔25，26〕，山奈酚在大鼠OA 中具有重要的抗炎和保护作用，其作用原理可能是通过IL-1β 刺激大鼠软骨细胞中的NF-κB 途径，可显著降低在IL-1β 刺激的大鼠软骨细胞中NO 和PGE2 水平及iNOS 和Cox-2 活动。异鼠李素是银杏叶提取物之一，具有显著抗炎、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节活性〔27〕，研究显示〔28〕，异鼠李素可以显著抑制iNOS 和PGE2 的产生及iNOS 和COX-2 的表达，从而使MIA 诱导的OA 大鼠体内的炎症因子水平降低，软骨细胞的丢失和软骨结构的破坏都得到了明显改善。在化合物-靶点网络中，作用靶点节点度靠前的为:NCOA2（12）、PTGS1（12）、PRSS1（10），亦说明这些靶点可能是化合物作用最多的靶点。研究表 明〔29〕核受体 共激活因子（NCOA）2 在许多生理和病理过程（包括发育，内分泌调节和肿瘤发生）中起重要作用。研究表明〔30〕，通过抑制老年OA 患者中滑膜细胞PTGS1 的表达，可以抑制OA 滑膜细胞的迁移/侵袭能力，并促进OA 滑膜细胞的凋亡率，改善OA 症状。

本研究结果说明IL-6、CASP3、VEGFA、MAPK8基因靶点与OA 的发病与治疗存在密切联系。研究表明〔31〕，通过敲低OA 大鼠模型的IL-6 基因，可以导致基质金属蛋白酶（MMP）-13 的表达和分泌受到抑制，可能与其抑制OA 软骨细胞中c-FOS/AP-1 活性介导的炎症刺激而发挥重要的抗炎作用有关。Cheng 等〔32〕研究提示miR-103a-3p 的上调可以显著促进细胞增殖，抑制凋亡和炎症，可能是与其抑制半胱氨酸（caspase）-3 的表达降低有关。研究表明〔33〕，中老年OA 患者的关节软骨、滑膜和软骨下骨中的VEGFA 上调，可以导致软骨变性、滑膜炎和骨赘形成，通过降低小鼠原代软骨细胞中VEGFA的表达，可以显著抑制OA 的进展。以上均表明，通过干预这些靶点，可以从分子机制角度出发，有效改善老年OA 患者的临床症状。该PPI 的分析中呈现出较其他基因联系较为密切的靶点基因，亦是疾病发生发展最重要的基因。

本研究结果表明TNF 信号通路、HIF 信号通路、NF-κB 信号通路、TLR 信号通路、PRL 信号通路、NLR 信号通路均与炎症反应、氧化应激、免疫调控等反应相关，研究表明〔34〕红花素通过促进AMPK 磷酸化和SIRT1 表达来抑制TNF 诱导的NF-κB 活化和内质网应激，从而保护老年OA 患者的软骨细胞并抑制炎症，防止了OA 中的软骨变性。研究证明〔35，36〕，炎性细胞因子、活性氧（ROS）和NO 也可能导致HIF-1α 的过度表达，临床数据表明，中老年OA 患者中HIF-1α 表达上调，HIF-1α 水平升高与OA 的发展有关。Yang 等〔37〕研究证实了抑制HIF-1信号转导通路，对老年OA 患者软骨细胞具有保护作用，其作用机制可能是抑制IL-1β 诱导的老年OA患者软骨细胞的炎症反应，降低IL-1β 刺激的软骨细胞中IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-3 和MMP-13 的促炎细胞因子水平。NF-κB 途径是涉及OA 发病机制的主要分解代谢途径之一，在与OA 相关的炎症介质的调节中起关键作用〔38，39〕，Chen 等〔40〕研究证明CA 显著抑制LPS 诱导的人OA 软骨细胞中NFκB 信号通路的活性，可以有效防治OA，其作用机制可能是通过抑制LPS 诱导的OA 软骨细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-13 和ADAMTS-5 的表达。先天免疫系统是OA 炎症周期的主要贡献者〔41〕，有研究表明〔42〕，TOLL 样受体（TLR）和NOD 型受体（NLR）信号转导通路在调节OA 患者组织稳态方面也起至关重要的作用，在OA 中，TLR 具有启动细胞防御和细胞死亡的双重能力，Barreto 等〔43〕研究亦证明TLR激活可以导致存活信号和凋亡信号，这可能会对健康细胞和患病细胞产生不同的相对影响，并增加OA 细胞死亡的趋势。

综上，黄芪-桑寄生-木瓜药对中的重要化合物与OA 重要作用靶点蛋白结合能非常接近，从分子角度亦可以说明其化合物可以很好与疾病的靶点蛋白结合，从而产生治疗作用，且对多种生物学功能与多条信号转导通路进行调节以达到治疗的作用。侧面也验证了黄芪-桑寄生-木瓜药对具备多化合物、多代谢渠道、多作用靶点的作用特征。