大孔树脂纯化小枝玫瑰总黄酮工艺研究

陈立格，王 莹，兰 卫

(1.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830017；2.江苏省盐城市第一人民医院，江苏 盐城 224000；3.新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830002)

药理学研究表明，玫瑰具有广泛的药理活性，玫瑰花具有抗病毒[1]、抗氧化[2]、降糖[3]、抑菌[4]等作用。对玫瑰花的研究主要集中在玫瑰红色素的提取[5]、花蕾的抗氧化能力[6]、化学成分与质量标准[7]、黄酮类成分的提取及抗氧化性能[8]、降糖作用等方面。小枝玫瑰(branchlet rose)主要生长在新疆和田地区和喀什地区，日照时间长，干旱少雨，生长期长，一年开花一次，产量低。小枝玫瑰与内地玫瑰差异较大，主要产品有玫瑰花酱、玫瑰花茶和玫瑰精油，南疆少数民族使用较多，北疆及内地使用较少。目前有关小枝玫瑰化学成分的提取、纯化、质量标准及生物活性的研究尚不充分。鉴于此，作者采用大孔树脂纯化小枝玫瑰总黄酮，采用紫外可见分光光度法测定小枝玫瑰总黄酮含量，考察大孔树脂类型、最大上样量、上样速度、洗脱剂体积分数、洗脱剂流速、洗脱剂用量对纯化效果的影响，对纯化工艺进行优化，为小枝玫瑰的深入开发利用提供帮助。

1 实验

1.1 药材、试剂与仪器

小枝玫瑰花(批号20170110)，新疆维吾尔药业有限公司。经新疆医科大学中医学院姚蓝副教授鉴定为蔷薇科植物小枝玫瑰(branchlet rose)的干燥花蕾。

芦丁标准品(批号20151221)，上海源叶生物科技有限公司；硝酸铝(批号20160512，分析纯)、亚硝酸钠(批号20160122，分析纯)、HPD-600大孔树脂(批号20150423)、HPD-100大孔树脂、X-5大孔树脂(批号20150324)、AB-8大孔树脂、D101大孔树脂(批号20150423)，天津永晟精细化工有限公司；氢氧化钠(批号20150212)、95%乙醇(批号20141203，分析纯)，天津风船化学试剂科技有限公司；甲醇(批号20150122，色谱纯)，Fisher公司；实验用水均为纯水。

UV2700型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；AS系列超声波清洗机，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；RC-FA系列电子分析天平，北京睿诚永创有限公司；玻璃仪器气流烘干器、RE-52B型旋转蒸发仪，河南郑州长城科工贸有限公司；ST-02A型中药粉碎机，浙江永康帅通五金工具有限公司；HH-S4型数显恒温水浴锅，金坛医疗仪器厂；A4001493型微量移液枪，上海(宝山区)艾测电子科技有限公司。

1.2 小枝玫瑰总黄酮的含量测定

采用紫外可见分光光度法测定小枝玫瑰总黄酮含量。首先参照文献[9]制备标准溶液和供试溶液；取标准溶液和供试溶液，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法显色[10]，在200～800 nm范围内进行扫描，发现标准溶液和供试溶液均在510 nm处有最大吸收，因此，后续实验选择510 nm为测定波长。然后取芦丁标准品定容，分别吸取0.1 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL芦丁标准溶液，浓度分别为0.001 18 mg·mL-1、0.011 8 mg·mL-1、0.023 6 mg·mL-1、0.035 4 mg·mL-1、0.047 2 mg·mL-1、0.059 0 mg·mL-1，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法显色，测定各浓度溶液在510 nm处吸光度，测定3次，取平均值，以吸光度(A)为纵坐标、芦丁浓度(c)为横坐标绘制标准曲线。再取供试溶液，按上述方法测定510 nm处吸光度，依据标准曲线方程计算小枝玫瑰总黄酮含量。

1.3 小枝玫瑰总黄酮的纯化工艺优化

1.3.1 样品溶液的制备

准确称取1.00 g小枝玫瑰花粉末于锥形瓶中，按料液比1∶16(g∶mL，下同)加入50%乙醇，在80 ℃下提取30 min，过滤，减压回收乙醇并浓缩至无醇味，冷冻干燥制成粉末。然后用50%乙醇配制小枝玫瑰总黄酮含量为0.8 mg·mL-1的样品溶液。

1.3.2 纯化工艺的优化

以纯化效果为评价指标，通过单因素实验对大孔树脂纯化工艺条件大孔树脂类型、最大上样量、上样速度、洗脱剂体积分数、洗脱剂流速、洗脱剂用量[11-12]等进行优化。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线方程与线性范围

按1.2方法测定0.001 18 mg·mL-1、0.011 8 mg·mL-1、0.023 6 mg·mL-1、0.035 4 mg·mL-1、0.047 2 mg·mL-1、0.059 0 mg·mL-1芦丁标准溶液在510 nm处的吸光度分别为0.004、0.089、0.201、0.318、0.430、0.528。以吸光度(A)为纵坐标、芦丁浓度(c)为横坐标绘制标准曲线，拟合得到线性回归方程为A=9.2389c-0.0127，R=0.9991，表明，芦丁浓度在0.001 18～0.059 0 mg·mL-1范围内与吸光度线性关系良好。

2.2 大孔树脂的选择

通过静态吸附-脱附实验和动态吸附-脱附实验考察5种大孔树脂HPD-600、HPD-100、X-5、AB-8、D101对小枝玫瑰总黄酮的纯化效果。大孔树脂使用前均用95%乙醇浸泡24 h。

静态吸附-脱附实验：准确称取预处理好的5种大孔树脂各2.0 g，用滤纸吸干后置于具塞磨口三角瓶中，加入小枝玫瑰总黄酮含量为1.998 mg·mL-1的样品溶液40 mL，室温下吸附24 h，取上层液1 mL，定容至10 mL容量瓶中，测定总黄酮含量，按式(1)计算比吸附量(mg·g-1)。然后将上述吸附饱和的大孔树脂用纯水清洗后，加入80%乙醇20 mL，在25 ℃水浴振荡24 h进行静态解吸，按式(2)、(3)计算比解吸量(mg·g-1)及解吸率(%)：

(1)

(2)

(3)

式中：c0为吸附前样品溶液中总黄酮含量，mg·mL-1；c1为吸附后上层液中总黄酮含量，mg·mL-1；V0为样品溶液体积，mL；m为大孔树脂质量，g；c2为洗脱液中总黄酮含量，mg·mL-1；V2为洗脱液体积，mL。

动态吸附-脱附实验：取预处理好的5种大孔树脂，湿法装柱10 cm；再以95%乙醇清洗，直到流出液澄清为止；然后用纯水洗至无醇味；加入小枝玫瑰总黄酮含量为0.1 mg·mL-1的样品溶液15 mL，用15 mL 95%乙醇洗脱，记录洗脱液的体积并测定洗脱液中总黄酮含量，按式(4)计算洗脱率(%)：

(4)

5种大孔树脂HPD-600、HPD-100、X-5、AB-8、D101对小枝玫瑰总黄酮的静态吸附-脱附和动态吸附-脱附效果见表1。

表1 5种大孔树脂对小枝玫瑰总黄酮的静态吸附-脱附和动态吸附-脱附效果

由表1可知，HPD-600大孔树脂对小枝玫瑰总黄酮的静态吸附效果及解吸效果都比较好；且动态吸附-脱附实验所用的洗脱液体积较少、洗脱率高出其它大孔树脂很多，是小枝玫瑰总黄酮分离纯化用较理想的大孔树脂。因此，后续实验选择HPD-600大孔树脂纯化小枝玫瑰总黄酮。

2.3 最大上样量的选择

HPD-600大孔树脂湿法装柱10 cm，加入样品溶液进行动态吸附实验。以总黄酮泄漏量为指标，考察上样量对小枝玫瑰总黄酮纯化效果的影响(图1)：将样品溶液过柱，分段(每10 mL收集一管)收集流出液，测定其在510 nm处吸光度，计算流出液中总黄酮含量，按式(5)计算总黄酮泄漏量(%)：

图1 上样量对小枝玫瑰总黄酮纯化效果的影响Fig.1 Effect of sampling amount on purification efficiency of total flavonoids from branchlet rose

(5)

由图1可知，当上样量超过270 mL时，流出液中的总黄酮明显增多，泄漏量明显增加，说明此时总黄酮开始明显泄漏。故，选择小枝玫瑰总黄酮样品溶液的最大上样量为270 mL。

2.4 上样速度的选择

HPD-600大孔树脂湿法装柱10 cm，最大上样量270 mL，分别以不同速度上样进行动态吸附实验。以总黄酮吸附量为指标，考察上样速度对小枝玫瑰总黄酮纯化效果的影响，结果见表2。按式(6)计算总黄酮吸附量：

表2 上样速度对小枝玫瑰总黄酮纯化效果的影响

吸附量=c0×V0-c2×V2

(6)

由表2可知，上样速度为1.5 mL·min-1时，小枝玫瑰总黄酮吸附量最大，为148.51 mg。故，选择上样速度为1.5 mL·min-1。

2.5 洗脱剂体积分数的选择

HPD-600大孔树脂湿法装柱10 cm，最大上样量270 mL，上样速度1.5 mL·min-1，分别用不同体积分数(30%、40%、50%、60%、70%)的乙醇作为洗脱剂进行动态吸附-脱附实验。分段收集洗脱液，稀释后测定其吸光度，考察洗脱剂体积分数对小枝玫瑰总黄酮纯化效果的影响，结果如图2所示。

图2 洗脱剂体积分数对小枝玫瑰总黄酮纯化效果的影响Fig.2 Effect of eluent volume fraction on purification efficiency of total flavonoids from branchlet rose

由图2可知，洗脱剂体积分数对小枝玫瑰总黄酮纯化效果的影响较大，40%乙醇的洗脱效果最佳。故，选择40%乙醇为洗脱剂。

2.6 洗脱剂流速的选择

HPD-600大孔树脂湿法装柱10 cm，最大上样量270 mL，上样速度1.5 mL·min-1，40%乙醇为洗脱剂，分别以不同流速洗脱进行动态吸附-脱附实验。分段收集洗脱液，稀释后测定其吸光度，以洗脱液中总黄酮质量为指标，考察洗脱剂流速对小枝玫瑰总黄酮纯化效果的影响，结果见表3。

表3 洗脱剂流速对小枝玫瑰总黄酮纯化效果的影响

由表3可知，当洗脱剂流速为 0.5 mL·min-1时，洗脱液中总黄酮质量最高，洗脱效果最佳，纯化效果最佳。故，选择洗脱剂流速为 0.5 mL·min-1。

2.7 洗脱剂用量的选择

HPD-600大孔树脂湿法装柱10 cm，最大上样量270 mL，上样速度1.5 mL·min-1，40%乙醇为洗脱剂，洗脱剂流速 0.5 mL·min-1，在洗脱剂用量分别为10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL时进行动态吸附-脱附实验。分段收集洗脱液，测定其在510 nm处吸光度，以洗脱液中总黄酮质量为指标，考察洗脱剂用量对小枝玫瑰总黄酮纯化效果的影响，结果见表4。

由表4可知，随着洗脱剂用量的增加，洗脱液中总黄酮质量迅速降低；当洗脱剂用量为60 mL时，洗脱液中总黄酮质量降至最低。故，选择洗脱剂用量为60 mL。

2.8 验证实验

取小枝玫瑰花粉末2.0 g，按料液比1∶20加入60%乙醇提取60 min；过滤，用蒸馏水稀释成总黄酮含量为0.8 mg·mL-1的样品溶液；在上述确定的最优条件下进行小枝玫瑰总黄酮的纯化：HPD-600大孔树脂湿法装柱10 cm，最大上样量270 mL，上样速度1.5 mL·min-1，40%乙醇为洗脱剂，洗脱剂流速0.5 mL·min-1，洗脱剂用量60 mL。收集洗脱液，水浴烘干，得小枝玫瑰总黄酮纯化粉末1.64 g；称取0.02 g粉末，加入100 mL甲醇搅拌溶解，精密吸取5 mL，定容至25 mL容量瓶中，测定吸光度，计算纯化粉末中总黄酮质量，按式(7)计算总黄酮转移率(%)，结果见表5。

(7)

由表5可知，在最优条件下对小枝玫瑰总黄酮进行纯化，3次验证实验得到的总黄酮转移率平均值为58.75%。表明，确定的最优纯化条件可行，纯化效果较好。

表5 最优纯化工艺条件下的验证实验结果(n=3)

2.9 讨论

静态吸附时，HPD-600大孔树脂对小枝玫瑰总黄酮的吸附优于其它型号大孔树脂，解吸也比其它型号大孔树脂容易；动态吸附时，HPD-600大孔树脂对小枝玫瑰总黄酮的吸附和脱附效果均比其它型号大孔树脂的要好。本实验采用HPD-600大孔树脂对小枝玫瑰乙醇提取物进行纯化，在进行多次吸附-脱附纯化后，小枝玫瑰总黄酮的纯度会降低。因此，在实际生产中应对小枝玫瑰总黄酮粗提物进行预处理，从而延长HPD-600大孔树脂的使用时间。

3 结论

通过单因素实验对大孔树脂纯化小枝玫瑰总黄酮的工艺条件进行了优化，确定最优工艺条件如下：HPD-600大孔树脂湿法装柱10 cm，样液浓度0.8 mg·mL-1，最大上样量270 mL，上样速度1.5 mL·min-1，40%乙醇为洗脱剂，洗脱剂流速0.5 mL·min-1，洗脱剂用量60 mL。在此条件下纯化得到的小枝玫瑰总黄酮中的总黄酮含量为23.24%，总黄酮转移率为58.75%。