不同pH对红螯螯虾胚胎离体孵化的影响

韦永春，程 顺，贾永义，迟美丽，刘士力，郑建波，李 飞，刘一诺，顾志敏

(1 上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306；2 浙江省淡水水产研究所，农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室,浙江省淡水水产遗传育种重点实验室，浙江 湖州 313001;3 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306)

红螯螯虾(Cheraxquadricariratus)(又名澳洲淡水龙虾)原产于澳大利亚北部和新几内亚南部等热带区域，具有生长快、养成规格大、可食比例高、肉质口感佳等优点，是世界名贵经济虾类之一。近年来，克氏原螯虾(Procambarusclarkii)等淡水螯虾类的市场需求急剧增加，红螯螯虾的产业规模也得以迅速扩大[1]。

红螯螯虾离体胚胎孵化技术是一种新型生产红螯螯虾幼苗的技术，该技术主要针对红螯螯虾抱卵孵化胚胎时间过长，以及抱卵过程存在不确定因素易导致出苗率偏低等实际阻碍产业发展的问题。随着离体胚胎孵化技术的发展，ZISS孵化器、Hemputin孵化设备以及运用水流和冲气悬浮技术已经被证实可用于通讯螯虾(Pacifastacusleniusculus)、红螯螯虾等螯虾离体胚胎的孵化，其中ZISS孵化器、Hemputin孵化设备可用于大规模生产红螯螯虾红螯螯虾幼苗[2-9]。ZISS孵化器主要是利用气举带动水形成反向水流原理，使红螯螯虾胚胎在一个可控的动态水流中处于不断翻滚状态，形成的稳定循环水流，使胚胎均匀而轻柔地翻动，为胚胎提供一个高氧孵化环境，且翻动的胚胎基本散开，可有效抑制病菌的传播。Cheng等[6]利用该装置，红螯螯虾胚胎孵化率在80%以上，一个生产季度共孵出虾苗10.65万尾。Hemputin孵化设备通过模仿抱卵母虾行为，将孵化架与提供动力的电机连接，使得孵化孵化架上的孵化盒前后上下摇动，出苗率从母体孵化的55%提高到65%[8]。Clive等[10]利用Hemputin孵化装置(Clive等将其命名为AquaVerde Incubator)，选取眼点期红螯螯虾的卵，一个批次可平均生产18万尾幼虾。从实际生产效果来看，ZISS孵化器出苗更稳定，缺点在于操作上相对Hemputin孵化设备麻烦，应用Hemputin在实际操作中更可行。但Jones等[11]学者认为，Hemputin孵化器的出苗率无法保证，且出苗偏低的原因尚未有明确定论。因此有必要筛选适宜红螯螯虾离体胚胎的孵化条件，而ZISS孵化器具有出苗率稳定、体积小巧、充气方便等特点，可用于筛选红螯螯虾离体胚胎孵化的最佳孵化水质条件。

本研究采用韩国施奇公司生产的孵卵器(ZISS孵化器)研究了不同pH条件下红螯螯虾离体胚胎孵化与初孵幼虾生长的影响，以期筛选出红螯螯虾离体孵化期间适宜的pH范围及最优的pH条件，为进行大规模红螯螯虾胚胎的离体孵化提供基础水质数据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究使用的孵化系统为以ZISS孵化器为主体的孵化水箱，水箱长70 cm、宽50 cm、高40 cm，1个水箱放入3个ZISS孵化器，即为3个平行试验组，水箱置于温室水泥池内，通过加热棒控制孵化用水水温。其中作为主体孵化装置的ZISS孵化器由孵化桶(容量500 mL，内径80 mm，高250 mm)、过滤海绵、硅胶管、橡胶、空气控制阀、气石、不锈钢网等部件构成(图1)。具有以下几个优点：(1)通过反气举的方式，提供了水与气的对流，不仅使运行期间循环水流更为稳定柔和，使胚胎均匀而轻柔地翻动，且翻动的胚胎基本散开，可有效抑制病菌的传播，还可提供更足的溶氧，并可有效培育硝化细菌，提高水质；(2)圆弧形的桶底可以保护孵化中的胚胎在翻滚中因水流波动不均或突然冲击导致的损伤；(3)顶部过滤设计可以有效解决因底部过滤棉的粗糙面刺伤胚胎；(4)运用该系统孵化期间需要消毒、挑死胚时ZISS孵化器易于取出，且死胚会浮于孵化器水面上层，轻轻倒出水时会与水一起排出，因此，ZISS孵化器为主体的孵化系统还具有小巧轻便、易于操作并且消毒处理方便的优点。

选用的红螯螯虾抱卵虾体质健康，来源于浙江省淡水水产研究所综合试验基地。水箱加水约120 L后，用30%～40%的氯化氢(HCI，宜兴市广汇助剂化工厂)和纯度大于96%的氢氧化钠(NaOH，生工生物工程股份有限公司)调节水体pH。

1.2 方法

用梳子轻柔地剥取处于7对附肢期(橘黄色)的胚胎，经过3 000 mg/L甲醛浸泡消毒15 min，随后置于ZISS孵化器中进行离体孵化(图1)，并且在虾卵阶段每隔一日进行3 000 mg/L甲醛浸泡消毒15 min，虾卵孵出后不进行消毒处理。

图1 ZISS孵化器及其原理图Fig.1 ZISS Incubator and its schematic diagram

试验设置5个pH试验组：6.8、7.7、8.4、8.9和9.4，通过定期检测与调节保持pH的稳定，水温为(28±0.5)℃，溶氧5 mg/L以上。每个试验组3个平行，各放200粒胚胎，每隔1 d统计所有试验组中死胚、死虾、孵化时间、出苗时间(发育至可自由运动的3期幼虾的时间)、出苗量(可自由运动的3期幼虾数量)等数据。

H=(J1/E)×100%

(1)

S=(J3/E)×100%

(2)

式中：H为孵化率(Hatching rate)；S为出苗率(Survival rate)；J1为初孵幼虾(Juveniles stage 1)数量；J3为可自由运动的3期幼虾(Juveniles stage 3)数量；E表示试验初胚胎数量。

1.3 数据处理

所有数据均用平均值±标准差表示，应用 SPSS 17.0进行单因素方差分析，Duncan's 多重比较分析各组间的差异显著性(P<0.05)。

2 结果

2.1 不同pH组的孵化率与出苗率

图2表明，各组孵化率均在84.0%以上，且各pH组间无显著性差异(P>0.05)，但pH 8.4组的孵化率略高于其他四组。pH对出苗率影响较大，pH较高或较低均影响出苗率，pH 7.7组和pH 8.4组显著高于其他三组(P<0.05)，pH为6.8时出苗率为0%，与pH 9.4组无显著性差异(P>0.05)，均显著低于其他三组(P<0.05)；在pH 7.7～9.4之间出苗率呈下降趋势。

注：上标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母则差异显著(P<0.05)。下同图2 红螯螯虾离体胚胎孵化率、出苗率与水体pH的关系Fig.2 The relationship between pH value and hatching rates,and survival rates

2.2 不同pH对胚胎孵化的影响

图3显示，不同pH对胚胎孵化的影响主要有3个方面：1)未发现孵化期间pH的变化导致胚胎大量死亡现象，所有试验组孵化率均在84.0%以上；2)各pH组胚胎死亡高峰集中在第5天，其中pH 8.4组在第5天的胚胎死亡数最低，显著低于pH 7.7、8.9与6.8三组(P<0.05)；pH 7.7组的胚胎死亡数最高，显著高于pH 8.4组和pH 9.4组(P<0.05)，第5天后死亡数目逐渐下降，但pH 6.8组在第19天仍有胚胎死亡个数升高的现象(图3)；3)pH 6.8组胚胎孵化时间较长，其他组均于第11～13天后孵出，该组至第19天后仍有部分活胚胎未孵出。

注：同一日平均值上标相同字母表示平均值间差异不显著(P>0.05)，同一日平均值上标不同字母则差异显著(P<0.05)。下同图3 不同pH条件下胚胎死亡数目随时间的变化Fig.3 Changes in the number of dead embryos under different pH conditions with time

2.3 不同pH对初孵幼虾出苗的影响

结果显示，不同pH对初孵幼虾出苗的影响主要有3个方面。1)孵出后pH的变化会导致幼虾大量死亡，其中pH 6.8组和pH 9.4组的出苗率分别仅为0%和1.5%。2)pH 9.4组于第11天最先开始出现幼虾大量死亡现象，随后pH 6.8组于第17天开始出现该现象，其他3组未出现某个时间点幼虾大量死亡的现象，即高pH组幼虾最先大量死亡，随后是低pH组，中间3组则未出现幼虾大量死亡(图4)。3)最高和最低pH组幼虾基本未出苗，其他3组出苗集中在第19天和第25天，以第19天为主。在第19天，pH 7.7和pH 8.4组的出苗量无显著性差异(P>0.05)，且均显著高于其他各组(P<0.05)；在第25天，pH 7.7组的出苗量显著高于其他各组(P<0.05)(图5)。

图4 不同pH条件下初孵幼虾死亡数目随时间的变化Fig.4 Changes in the number of dead juveniles under different pH conditions with time

图5 不同pH条件下初孵幼虾出苗数随时间的变化Fig.5 Changes in the number of newly hatched juveniles under different pH conditions with time

2.4 出苗率与水体pH的回归方程与极值分析

出苗率与水体pH的二次回归方程为：y=-40.465x2+654.572x-2578.188(R2=0.964)，结果可知，判定系数R2=0.964，显著性水平为0.000，说明二项式回归方程的回归效果非常显著，即pH与出苗率的检出系数拟合程度很好(图6)。

图6 出苗率与水体pH的二次回归方程Fig.6 Quadratic regression equation between survival rate and pH value

根据二项式回归方程求极值点的公式，x=8.088时，y得到最大值68.942 3，因此，根据该回归方程，当pH为8.1时，红螯螯虾离体胚胎出苗率达到最高的68.94%。

3 讨论

3.1 pH对离体胚胎孵化的影响

雷慧僧[13]曾报道，过低的 pH 使鱼类胚胎膜软化，失去弹性，胚胎易破膜死亡；pH 过高，卵膜也会提前溶解而使胚胎死亡。丁宏印等[25]研究发现，水的pH影响锯缘青蟹(Scylla serrata)胚胎发育，水体适宜pH为7.0～9.0，最适pH为7.8～8.2，且胚胎大部分在复眼色素形成期死亡发生。Magallon 等[26]研究表明，pH为9时，凡纳滨对虾的孵化率较低。本研究中，所有试验组离体胚胎孵化率均在84.0%以上，且各pH组的孵化率无显著性差异，说明孵化率受pH影响较小，推测可能是因为红螯螯虾胚胎卵膜较厚，胚胎在卵膜的保护下，对水中pH的变化不敏感。各试验组胚胎死亡高峰期主要发生在孵化第5天，这可能与胚胎至第5天时基本发育至复眼色素形成期有关，该时期的胚胎开始主动吸收离子，对外界环境变化较为敏感[27-28]。鉴于第5天 pH 8.4组的胚胎死亡数最低，显著低于pH 7.7、8.9和6.8三组(P<0.05)，可能是因为当胚胎发育至复眼色素形成期后继续发育需要新物质和能量，而新物质的产生和能量的释放都需要在酶在活力较高时才能有效完成，因此，综合推测pH为8.4更有利于离体胚胎内酶活性的提高。这与丁宏印等[25]结果相一致。他们也推测胚胎的阶段性死亡与其发育至复眼色素形成期。该期对外界环境较为敏感，需要适宜的环境以提高酶活性[25]。本研究还发现，在低pH条件下，离体胚胎孵化时间较长，胚胎孵化受到明显抑制。苑彦中[12]的研究也认为，红螯螯虾孵化期间pH不宜在7.0以下，否则可能造成孵化困难或者孵化期延长。丁宏印等[25]的研究表明，孵化水体pH≤6.8时会明显降低胚胎发育速度，并认为在pH过低时，卵膜结构和酶活性会发生改变，使得其渗透压平衡与新陈代谢水平失调，造成其某一结构破坏或失去功能，影响其孵化。因此，可以推测，pH 6.8组胚胎孵出延缓是因为低pH影响胚胎内与孵化相关的某些功能的表达，具体原因需要深入探索。

3.2 pH对孵出后幼虾出苗的影响

3.3 基于该离体孵化系统的pH工程化控制

Perez等[40]于20世纪提出孵化系统对淡水螯虾类胚胎离体孵化的成功有重要影响。Joly等[41]研究认为，红螯螯虾养殖技术已较成熟，下一步的关键应该是开发适宜的孵化系统。结合当前渔业智能化、数字化、工程化的大趋势，认为红螯螯虾离体孵化的研究方向是适宜的离体孵化系统的开发及智能化、数字化、工程化的配套。今后的研究可以基于该离体孵化系统，通过物联网技术将水质传感器、增氧设备、控温装置、水循环等设备集成，实现对当下离体孵化生态数据的实时采集，辅助管理人员对当下孵化情况的实时掌握，提高孵化效率，保证生产安全。通过对包括pH在内的整个孵化环境的具体指进行标监控，并对水质指标阈值进行设置，对突发事件及时响应，实现工程化控制，如根据pH等探头的数据反馈，对孵化用水的排出与清洁水的汇入等进行自动化调节，保证水质的稳定等。因此，本次研究的结果可以为今后pH工程化控制与智能化离体孵化提供数据支持。

4 结论

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